变异链球菌中抗坏血酸特异性磷酸转移酶系统相关基因的初步研究口腔临床医学专业论文.docxVIP

硕士学位论文变异链球菌中抗坏血酸特异性 硕士学位论文 变异链球菌中抗坏血酸特异性 磷酸转移酶系统相关基因的初步研究 硕士研究生：吴听或 指导教师：赵望泓教授 摘要 研究背景及目的 龋病是危害人类口腔健康最常见的疾病，目前较为公认的致龋菌之一是变异 链球菌(Streptococcus mutans，＆mutans)。＆mu幻ns可通过代谢碳水化合物， 从而发挥产酸、耐酸、黏附、合成胞外多糖、形成生物膜等与致龋相关的生物学 特性。 通过对S mutans UAl59全基因组测序的分析表明，S mutans有15％的基因 与碳水化合物的代谢有关，呈现出强大的碳水化合物代谢能力。s mutans可以 多种方式吸收转运碳水化合物，但最主要、转运效率最高的方式为磷酸烯醇式丙 酮酸：磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate—dependent：phosphotransferase system，PTS)。 PTS一般由三部分组成，分别为酶I(enzyme I，EI)、含组氨酸的磷酸载体 蛋白(histidine-containing phosphocarrier protein，HPr)，以及酶II(enzyme II， Eli)复合体。其中EI和HPr不具有底物特异性，而EII复合体具有底物特异性， 一般由IIA、liB和IIC三个结构域组成，负责对特定底物的磷酸化及跨膜转运。 由于PTS在碳水化合物的转运代谢中发挥着重要作用，关于PTS的研究受到国 内外众多学者的关注。目前已有学者针对s mutans特异性转运葡萄糖、蔗糖、 果糖、乳糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇的PTS展开研究，但尚未有关于S mutans 万方数据 中文摘要抗坏血酸特异性PTS的研究。 中文摘要 抗坏血酸特异性PTS的研究。 ptxA基因(NCBI GenelD：1027857)与ptxB基因(NCBI GenelD：1027854) 分别编码S mutans uAl59 PTS中抗坏血酸家族Eli复合体中的EllA和EIIB。有 学者曾经对PtxA、PtxB蛋白的三维晶体结构进行解析，并进行体外酶活性实验 研究，发现这两个蛋白对抗坏血酸的磷酸化具有特异性，并推断PtxA、PtxB蛋 白应与s mutans对抗坏血酸的转运有关。 抗坏血酸在自然界中分布广泛，尤其在水果及蔬菜中含量丰富。研究发现， 许多细菌均可在无氧条件下发酵抗坏血酸，以获得维持生命活动的碳源，如大肠 杆菌、乳酸杆菌、肺炎杆菌等。本课题组前期研究发现，＆mutans亦可在厌氧 环境中发酵抗坏血酸，以维持生存。而如果敲除＆mutans的ptxA基因，其抗坏 血酸的代谢将出现障碍，ptxA基因缺陷的S mutans在抗坏血酸特异性培养基中 的生长、产酸、形成生物膜能力均受到明显影响。 鉴于ptxA基因在S．mutans抗坏血酸代谢中发挥的重要作用，为了探究ptxA 基因上游的ptxB基因是否也发挥着类似的作用，并明确它们之间的关系，本研 究拟构建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因双重缺陷菌株，及其功能补偿菌 株，研究上述缺陷菌株和补偿菌株在抗坏血酸特异性培养基中的生长、产酸、耐 酸、合成胞外多糖及形成生物膜的能力，明确ptxA、ptxB基因对S．mutans生物 学特性的影响。此外，对ptxA、ptxB基因及其邻近基因的转录情况进行分析， 以加深对S．mutans抗坏血酸特异性PTS的理解。 第一章变异链球菌ptxA、ptxB基因缺陷菌株及其功能补偿菌株的 构建 目的： 构建ptxB基因缺陷菌株和ptxA、ptxB基因双重缺陷菌株，并另外构建ptxA 功能补偿菌株、ptxB功能补偿菌株和ptxA、ptxB功能补偿菌株，为后续研究奠 定基础。 II 万方数据 硕士学位论文方法： 硕士学位论文 方法： 根据S mutans UAl59全基因组的序列，采用Primer Premier 5．0软件设计目 的基因的上下游引物，并PCR扩增上下游片段。以pFW5质粒为载体，通过双 酶切，将上下游片段插入至质粒的两个多克隆位点中，构建目的基因缺陷的重 组质粒。而后，在感受态刺激肽的作用下，将此重组质粒转化入野生型S mutans UAl59中，构建基因缺陷菌株。利用类似方法，以pDL278质粒为载体，构建 功能补偿质粒，而后转化入相应的基因缺陷菌株中，构建功能补偿菌株。 结果： 经过PCR鉴定和测序鉴定，ptxB缺陷菌株(ptxB．)、ptxAB双重基因缺陷菌 株(ptxAB一)、ptxA功能补偿菌株(CptxA一)、ptxB功能补偿菌株(CptxB．)和ptxAB 功能补偿菌株(cptxAB一)构建成功。 第二章变异链球菌p比4、ptxB基因对其生物学特性的影响 目的： 研究S m