实时荧光单引物等温扩增技术检测克罗诺杆菌的研究微生物学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文巾特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑耋堡盛些苤堂或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作r明确 的说明并表示谢意。 学位沦文作者签私：№ 签字曰期： 卸砖 年，月汐目 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盔些苤鲎。有关保赠、使用学位论文的规定，有权 保留并向嘲家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被奄阅和借阅。本人 授权塑耋垦盛些盘堂w以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行梭索，可以 采刷影印、，缩印或扫拙等复制手段保存、，【：编学位论文。 (保密的学位论文在解密厢适用本授权书) 学位论文作者签铝： 导师签名： 蝉 f 签字日期： 加16年，月；口翮 签字翻期：弘为年t月如翻 学位论文作者毕_驰后去向： 。t作单位： 电话： 通讯地岛}=： 邮编： 万方数据 摘要 摘要 克罗诺杆菌(Cronobacter)是一种普遍存在于自然环境中的条件致病菌，不但存 在于被污染的食品和食品工厂中，还几乎能够从所有的环境中分离得到。感染克罗诺 杆菌的高危人群是婴幼儿，死亡率高达20％---50％，幸存下来的婴幼儿也可能导致严 重的神经系统后遗症。因此，建立一种在婴幼儿奶粉中快速、灵敏、高效、可靠的检 测克罗诺杆菌的方法是至关重要的。 实时荧光单引物等温扩增技术(I心．SP队)是以单引物等温扩增技术(SP认)为 理论依据，将荧光染料与SPIA技术相结合，利用恒温扩增实时荧光检测系统(DEAOU 刖玎II)，将实时荧光监测仪与电脑相连，通过荧光信号的积累，实时监测反应进程， 可自动判定反应结果的阴性与阳性，并生成反应结果图。 根据克罗诺杆菌在GenBank中16S rRNA基因(HQ880288．1)，利用软件Primer Premier 5．0、DNAMAN设计RF．SPIA引物及Blocker，对反应体系中各添加物条件进 行优化，确定25“L的I心．SP认的反应体系：25 mmol／L MgS04 0．8 pL，10 mmol／L dNTPs 2．0 pL，10 pmol／L引物2．0 laL，2xBcaDNA聚合酶缓冲液2．0¨L，5xRNaseH 缓冲液1．5 uL，40 U／pL核糖核酸抑制剂0．6 pL，20 mg／mL Bovine Serum Albumin 0．9 “L，10 Ltmol／L Blocker 1．0 pL，20 U／p．L BcaDNA聚合酶1．0“L，60 U／pL RNaseH 0．6 uL，模板1．0 pL，SYBR Green II(1：400)1．0 pL，RNase．free Water补足反应体系。 RF．SPIA反应程序：扫描频率为60 S一次，反应温度为61℃，反应时间120 min(通 过观察反应情况随时停止)。 本研究以15株克罗诺杆菌和29株非克罗诺杆菌作为试验菌株进行RF．SPIA试 验的引物特异性验证，发现阳性结果均为克罗诺杆菌株，其余非克罗诺杆菌菌株结果 均显示阴性，由此证明试验所设计的引物特异性高，可用于克罗诺杆菌的检测。本试 验对克罗诺杆菌纯培养的灵敏度达到1．4xlOo CFU／mL，对克罗诺杆菌基因组的灵敏 度达到7．5x101 fg／mL，将克罗诺杆菌人工污染婴幼儿配方奶粉，并测定其检出限达 到8．1×102CFU／g。通过离心沉淀及紫外照射，试验结果可用肉眼直接观察。 本研究所建立的实时荧光单引物等温扩增技术检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆 菌的方法特异性强、灵明度高，方便快捷，还可肉眼观察结果。该检测方法不需要繁 琐的电泳过程，操作简单，为快速检测食源性致病菌建立了一个技术平台，更利于基 层检验检疫机构的应用。 关键词：克罗诺杆菌；单引物等温扩增；实时荧光；16S rRNA：检测 万方数据 Real--time Real--time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification(RV-·SPIA)for Detection of Cronobacter Name：Chen Ying Li Major：Microbiology Supervisor：Professor Zhang Wei Abstract Cronobacter is a kind of opportunistic pathogen which is widespread in natural environment．