胶质母细胞瘤替莫唑胺耐药机制的亚细胞蛋白质组学研究外科学神外专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 硕士学位论文行显著性差异分析，找出可能与 硕士学位论文 行显著性差异分析，找出可能与TMZ耐药密切相关的差异蛋白，以期揭示GBM TMZ耐药机制以及发现新的能够增加TMZ敏感性或抑制TMZ耐药的生物标志 物，为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供新的理论依据。而为了下一步深入探讨筛 选出的差异蛋白的功能，良好的细胞模型是后续研究的基础，原代细胞因性质 和特点上更接近于肿瘤在人体的原始状态，因此是目前研究肿瘤致病机制、放 化疗抵抗和肿瘤细胞的分子生物学特性的最常用的工具。然而，传统的胶质瘤 原代细胞培养方法耗时长，操作繁琐，成功率低，因此我们对其进行了改良， 成功培养了足量的原代胶质瘤细胞，为下一步细胞水平验证差异蛋白功能提供 了良好的工具。 第一部分：TMZ作用U87细胞1W后亚细胞蛋白组学识别和定量差异蛋白 目的：采用亚细胞蛋白组学label．free法识别和定量TMZ持续作用U87细胞1 周后胞浆蛋白和胞核蛋白差异表达蛋白，筛选与GBM TMZ耐药密切相关的差 异蛋白及通路，探讨TMZ的耐药机制，以期发现新的能够增加TMZ敏感性或 抑制TMZ耐药的生物标记物。 方法：取生长状态良好的U87细胞，加入TMZ(2009M)持续作用1周，使用 二甲基亚砜(DMSO)持续作用l周作为对照组，细胞形态观察及检测以上两 组的存活细胞数及细胞活力。收集以上各组条件下的U87细胞进行核质分离， 提取胞浆蛋白和胞核蛋白样品，考马斯亮蓝法对各组蛋白定量，采用蛋白质印 迹法Western Blot，兼容质谱银染法及质谱分析验证胞浆蛋白和胞核蛋白纯度及 处理因素的有效性(所有实验生物学重复3次)。收集生物学重复三次的胞浆蛋 白和胞核蛋白样品，采用亚细胞蛋白组学Label．free法识别和定量各组细胞胞 浆蛋白与胞核蛋白，以蛋白含量变化倍数+／．2．0且P value0．05为筛选标准， 筛选差异蛋白，对TMZ组和DMSO组胞浆差异蛋白和胞核差异蛋白在GO功 能注释及KEGG通路注释基础上，分别进行GO富集分析和KEGG富集分析， III 万方数据 摘要找出与 摘要 找出与TMZ密切相关的差异蛋白。 结果：TMZ(200I，tM)持续作用U87细胞系1周后，U87细胞形态发生显著变 化，细胞突起变长，细胞胞体变大、变长。实验组U87细胞活力明显下降，与 DMSO组比较，存活细胞数也显著减少。与前期实验结果细胞表型相符。各组 U87细胞核质分离后胞浆蛋白和胞核蛋白定量准确，蛋白总量满足后续实验需 求。蛋白质印记法Western Blot结果显示，各组胞浆蛋白中基本无胞核蛋白表 达，胞核蛋白中无胞浆蛋白表达，蛋白间没有相互污染，核质分离成功。兼容 质谱银染法结果显示，蛋白质条带清晰，实验组和对照组间蛋白表达差异明显。 质谱分析显示组内样品信号峰的分布以及质谱信号强度相似，而组间样品信号 峰的分布以及质谱信号强度差异明显。亚细胞非标记定量蛋白组学Label．free 法识别和定量各组细胞胞浆蛋白与胞核蛋白表达的改变后，从原始数据中质谱 定性到的蛋白质共计3910个。按照筛选标准，共筛选出差异蛋白304种，其中， TMZ组和DMSO组胞浆蛋白筛出差异蛋白数目148个，上调蛋白数量90种， 下调蛋白数量58种。胞核蛋白筛出差异蛋白156个，上调蛋白数量76种，下 调蛋白数量80种。通过对差异蛋白进行GO富集分析发现，在胞浆蛋白中上调 的差异蛋白在细胞内定位、分子功能及参与的生物学过程有集中趋势，细胞内 定位主要分布在核糖体上，从分子功能看，其主要功能与核糖体结构组分相关， 而从参与的生物学过程看，主要集中在参与翻译及翻译后的修饰过程；而在胞 浆蛋白中下调的差异蛋白在细胞内定位、分子功能及参与的生物学过程上未表 现出集中趋势。在胞核蛋白中上调差异蛋白在细胞内定位及参与的生物学过程 及分子功能上有集中趋势，从细胞内定位分析看上调差异蛋白主要集中在细胞 核上，而分子功能主要与DNA的复制、转录相关，主要参与核酸、含碱基化 合物及染色质重塑的过程；在胞核蛋白中下调的差异蛋白在细胞定位、分子功 能及参与的生物学过程也未出现明显的集中趋势且与TMZ的作用没有明显的 相关性。差异蛋白KEGG通路富集分析发现在胞浆蛋白中，上调的差异蛋白主 要RNA转运信号通路、Ribosome信号通路及Ribosome biogenesis in eukaryotes IV 万方数据 硕士学位论文信号通路密切相关。在胞核蛋白中，上调的差异蛋白主要与 硕士学位论文 信号通路密切相关。在胞核蛋白中，上调的差异蛋白主要与mismatch repair信 号通路，Transcriptional misregulation in cancer信号通路及Spliceo