体内药物分析 2.ppt

微透析技术 陈梦娟 1、什么是微渗透技术 微透析技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术。具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点。可在麻醉或清醒的生物体上使用，特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。 　　 随着微透析技术的迅猛发展，已经逐步受到生物医学和分析化学界的关注。这项技术已经成功地用于测定细胞液中的多种神经递质、氨基酸、葡萄糖、腺苷及其代谢产物、磷脂等小分子化合物。 2、微透析技术的主要原理 主要原理： 以透析原理作为基础，通过对插入生物体内中的微透析探头在非平衡条件下进行灌流，物质沿浓度梯度逆向扩散，使被分析物质穿过膜扩散进入透析管内,并被透析管内连续流动的灌流液不断带出，从而达到活体组织取样的目的。 3、微透析系统及其特点 　1、微透析系统装置主要由微量泵、微透析探头、收集器、连接管及配套设备组成。如下图： 2、目前微透析系统主要有两种模式：探针和微旁流(见图2） 3、微透析系统~ 探针 探针的类型： a线性探针：其微透析膜暴露在中间某一区域，探针的两边用环氧树脂黏合覆盖，可将透析膜部分充分包埋在靶组织里； b同轴探针：其灌流液通过探 针是同轴的，其取样时仅有单独的取样点，确保微透析取样时对体内有关组织造成最小损伤； c柔性探针：将熔融硅管表面覆盖一层柱形透析膜，此探针具有足够的柔性，可用于清醒动物的血管等部位的血药浓度测定。 3、微透析系统~ 探针 探针类型的选择主要根据插入的部位而定 线性探针主要用于球型组织的取样 同轴探针普遍应用于活体脑透析 柔性探针可用于运动动物,允许探针弯曲,以免损伤组织 4、微透析技术的基本操作步骤 微透析技术可以直接测定游离状态的药物，其基本操作步骤如下： 将动物麻醉后或在清醒状态下，将微透析探针埋人欲测定部位，其透析膜的长度取决于待测部位的大小，一般为1～4mm； 探针埋入后，灌流液由微量注射泵以低流速(1～5ul/min)注入探针； 因微透析液混有破碎细胞的细胞内成分及取样对象，对取样环境新异刺激的反应等因素会影响测定结果，故最初90min收集的透析液应弃去，待达到稳定状态后，再开始收集微透析液进行测定。 5、微透析技术的优点 优点： 探针具有较小的尺寸，取样时对组织器官损伤小； 可以进行活体连续取样，从而能够获得较为真实的浓度一时间曲线，对阐明药物在体内的代谢和转化过程具有积极的意义； 可以在生物体不同部位同时取样，从而研究药物在体内的分布情况； 可用于靶向给药，将药物加入灌流液中，直接进入组织器官，从而可对药物的局部作用和代谢情况进行评价； 获得不含蛋白质等生物大分子的样品，可以测定游离态药物的浓度，还可以直接与检测器相联接，实现在线检测。 6、探针回收率 探针回收率： 探针回收率是指从灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比的百分数。 对取出的样品进行准确可靠的校正，主要涉及到对探针的回收率的测定。 影响探针回收率的因素： a.取样部位的生物学性质 b.透析膜的物理性质(材料、孔径、长度及几何形状等) c.待测物质的分子量 d.灌流速度、压力 e.生物体本身的健康条件和生物节律等。 7、测定回收率的方法~ 体外校正 体外校正(体外回收率) 当不需测定样品的绝对含量，只需计算被测药物相对浓度的变化时，可采用体外回收率测定方法。测定宜在取样前后立即进行，将探针放入已知浓度的标准溶液中，用与体内实验相同的流速灌流探针，达到稳定状态后收集灌流液并进行测定。测定浓度与标准溶液浓度之比就是体外回收率。实验前后回收率的误差小于5％。 7、测定回收率的方法~ 体内校正 1、内标法: 将已知浓度的内标加至灌流液中，假设透析液中待测物与内标的回收率一致，通过内标法定量求得待测物的绝对量。灌流液中内标物的已知浓度(Cic)，透析液中内标物的浓度(Cec)，体内回收率(Rin，viv)可用下式计算： Rin，viv=(1一 Cec/Cic )×100％ 此法要求内标符合以下条件 ： ①内标必须与待测物化学结构相近； ②两者在血液及组织中的扩散及消除速度一致； ③内标不影响所研究药物在组织中的药理活性。 7、测定回收率的方法~ 体内校正 2、零净流量法: 当透析液中被分析物浓度与体内浓度一致时，没有物质交换，达到