大豆皂甙ba抑制棕榈酸诱导的巨噬细胞炎症反应活性及其机理研究营养与食品卫生学专业论文.docxVIP

硕士学位论文或24 硕士学位论文 或24 h。④NF—r,B信号通路相关蛋白(p65／p-p65、IKBa／p-Ir,Bot)的表达检测： 50-250 Irtmol／L PA处理；20～200 I．tmol／L SSB。预孵育2 h后250 I，tmol／L的PA处 理30 min。收集细胞后提取样品总蛋白，测定蛋白浓度后用PBS和5x SDS Loading Buffer按所需浓度稀释样品蛋白，加热蛋白变性后进行SDS．PAGE电泳、 转膜、抗体孵育与显影，得到的蛋白条带使用凝胶图象处理系统分析目标带的 分子量和净光密度值。 3．FQ．PCR检测mRNA表达 细胞的培养和处理：①LPS诱导的细胞炎症模型阳性对照组的建立：0．2-2 gg／mL LPS处理6 h；0．1～1 I．tg／mL LPS处理24 h。②PA诱导的细胞炎症模型的 建立：50～250 I．tmol／L PA处理6 h或24 h。③SsB。干预PA诱导的细胞炎症模型： 20～200 I．tmol／L SSB。对细胞进行预孵育2 h，然后用250 Irtmol／L的PA处理6 h 或24 h。收集细胞后用Trizol法提取总RNA，然后对样品中总RNA的浓度及纯 度进行测定，通过逆转录反应将总RNA逆转录生成cDNA，测定cDNA的浓度 及纯度，使用FQ．PCR试剂盒将cDNA在Real Time PCR仪上扩增出目的基因 COX．2、iNOS、TNF．0【、IL．113和IL．6，以13-actin作为内参基因，采用比较C(t) 值的相对定量法，根据△△Ct计算出处理组与对照组之间目标基因的表达差异 2一△△Ct。 4．ELISA测定TNF．13,浓度 0．2-2 I．tg／mL LPS处理6 h；50-250 I_tmol／L PA处理6 h；20-200 lamol／L SSB。 预孵育1 h，然后用250 I．tmol／L的PA处理6 h。设阴性对照组。处理日,-tlN结束 后收集细胞皿内的培养基，离心后使用相应试剂盒进行ELISA测定，结合标准 品标准曲线计算检测样品中的TNF．Ⅸ浓度。 5．台盼蓝计数法 20～200}tmol／L SSB。对细胞进行处理6 h或24 h，载玻片上台盼蓝使用液与 细胞悬液按1：1充分混合后，3 min内显微镜下观察并计数蓝染和未蓝染的细胞， 统计每个样品的相对细胞抑制率和活细胞率，采用SPSS软件Probit概率单位模 万方数据 摘要型计算细胞增殖半数抑制浓度(IC，o)。 摘要 型计算细胞增殖半数抑制浓度(IC，o)。 6．统计处理 结果以均数4-标准差(E+_SD)表示。采用统计软件SPSS 19．0分析，运用单 因素方差分析进行多个样本均数比较，进行分析之前先进行方差齐性检验，如 果方差齐，运用LSD法进行组间比较；如果方差不齐，运用Dunnett’S T3法进行 组间比较。采用SPSS l 9．0软件Probit Analysis概率单位模型计算细胞增殖半数 抑制浓度。 结果 1．PA对RAW264．7小鼠巨噬细胞增殖活力的影响 PA对RAW264．7小鼠巨噬细胞的增殖活力呈浓度和时间抑制效应，PA处理 RAW264．7小鼠巨噬细胞6、12、24、48和72 h的IC50值分别为610．51、433．42、 217．11、167．29和132．20 gmol／L。结合WB实验中炎症酶的蛋白表达情况，将 PA的处理浓度设定为50～250 lamol／L，处理的时间设定为6 h或24 h。 2．SSB。对RAW264．7小鼠巨噬细胞增殖活力的影响 SSB。对RAW264．7小鼠巨噬细胞的增殖活力呈浓度和时间抑制效应，SSB。 处理RAW264．7小鼠巨噬细胞6 h和24 h的IC50值分别为4139．03 gmol／L和 4020．76 gmol／L，表明其毒性较小。本实验将sSB。的干预浓度设定为20、50、 100和200 lamol／L，预孵育的时间为1 h或2 h。 3．LPS刺激RAW264．7小鼠巨噬细胞建立炎症模型 0-2 gg／mL的LPS刺激RAW264．7小鼠巨噬细胞6 h或24 h，炎症酶(COX．2 和iNOS)mRNA和蛋白表达水平以及促炎细胞因子(TNF．值、IL．113和IL．6)的 mRNA表达水平均呈浓度依赖性显著升高(JP0．05)。LPS刺激6 h后TNF．0【在 细胞培养上清中分泌量显著升高(尸0．01)。 4．PA刺激RAW264．7小鼠巨噬细胞建立炎症模型 50～250 pmol／L PA处理6 h或24 h，可呈浓度依赖性显著增加炎症酶(COX．2 和iNOS)的mRNA与蛋白表达水平(P0．01)、促炎细胞因子(TNF．IJ．