超顺磁性氧化铁促进大鼠脂肪源性干细胞成骨分化的研究外科学骨外专业论文.docxVIP

博士学位论文技术具有空间和时间分辨率高、对比度好、有效成像时间长、无创性等优点， 博士学位论文 技术具有空间和时间分辨率高、对比度好、有效成像时间长、无创性等优点， 可动态观察标记细胞的迁徙过程，同时获得分子、生理及解剖等信息，成为评 价干细胞移植效果以及优化治疗方案的理想选择，由此产生了磁共振分子影像 学这门学科。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)是一种通过美国FDA认证的新 型T2磁共振造影剂，已有商业化产品用于临床。由于具有超顺磁性，SPIO在 外加磁场的作用下可产生更强的局域磁场，强烈影响氧化铁纳米颗粒周围水分 子中氢质子的弛豫过程，明显缩短T2时间，使所获得的T2加权影像变暗， 表现出负增强效果。多项研究表明，超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记间充质干细 胞后，不会改变其形态特征，也不会抑制其增殖。目前，采用SPIO标记的磁共 振活体示踪干细胞(包括骨髓间充质干细胞与脂肪源性间充质干细胞)己应用 于心肌梗死、脑缺血、脊髓损伤、周围神经损伤和股骨头缺血性坏死等多种疾 病模型中。SPIO作为外源性金属异物，进入机体后不可避免会受到免疫细胞的 识别、吞噬和降解，已有研究发现，SPIO可明显提高Jurkat T细胞的增殖能力 和活力。同样，当SPIO标记ADSCs后，对其增殖和活力是否造成影响?加入 成骨分化诱导剂共同培养后，是否对ADSCs成骨分化进程造成影响?机制何 在?本实验拟通过分离SD大鼠脂肪组织获取ADSCs后，加入SPIO进行体外 共培养，最后加入成骨分化诱导剂进行定向成骨分化，初步探讨SPIO对ADSCs 成骨分化的影响及在基因水平上可能存在的调控机制。 目的 1、探讨超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记ADSCs后，对其增殖和活力造成的影 响。 2、SPIO标记ADSCs后，加入成骨分化诱导剂诱导ADSCs定向成骨分化， 研究SPIO对ADSCs定向成骨分化所造成的影响。 3、研究SPIO对ADSCs表达成骨相关基因造成的影响。 方法 1、分离SD大鼠ADSCs，进行体外培养及传代，倒置显微镜下动态观察原 ill 万方数据 中文摘要代和传代培养的ADSCs的生长形态、结构变化及比较各代之间的差异。 中文摘要 代和传代培养的ADSCs的生长形态、结构变化及比较各代之间的差异。 2、分别以CD34、CD44、CD45、CD90抗体标记ADSCs，使用流式细胞 仪检测分析其细胞免疫表型。 3、将经SPIO标记的ADSCs设为实验组，无SPIO标记的ADSCs设为对照 组，分别接种于24孔培养板中，接种密度为5x104个细胞／孔；使用手持式细胞 计数仪在培养第1、2、3、4、5、6、7天分别对两组细胞进行计数，并描绘生 长曲线图。 4、诱导ADSCs成骨分化：将实验组和对照组ADSCs接种于6孔板中，接 种密度为3x104个细胞／孔；加入足够的常规完全培养液，放在37C，5％C02的 培养箱中培养24h；当细胞融合至50％．70％时，小心吸去旧的培养液，每孔加 入2ml的成骨分化诱导液培养基(含O．1“mol／L地塞米松、10 mmol／Lp-甘油磷 酸钠、50 gmol／L抗坏血酸)，每隔2．3天更换新鲜的成骨分化培养基，诱导分化 2．4周。 5、ALP活性测定：取成骨诱导培养7、14、21及28 d的两组细胞，吸去 培养液后PBS液清洗2次，加入1 ml PBS液，收集细胞，使用超声波细胞破碎 仪裂解细胞，进行冻结一融化_冻结一融化操作，再以离心半径10 cm、3000 r／min离心10 min；吸取上清液移到新的试管作为样品。向培养板内添加loopl 底物缓冲液和20p,1样品，震荡器上充分振荡1分钟后，37C下孵育15分钟。添 加809l反应终止液，震荡器上充分振荡1分钟，用酶标仪测量波长520 nln处的 吸光值OD值，并按试剂盒所提供的公式计算各组ALP活性(金式单位／100 m1)。 每组3个样本。 6、茜素红染色法检测细胞外基质矿化率：取成骨诱导分化培养7、14、21 及28 d的两组细胞爬片，吸去培养基，并用lxPBS洗3次，每次5rain；加入 2ml的4％中性甲醛固定4*(230分钟；30分钟后，吸去固定液，并用I×PBS漂洗 3次，每次5 rain；每孔加入lml的0．1％茜素红染液，37(2作用30 min；去除 染色液，并用漂洗3次，每次5 rain；自然干燥，中性树胶封片；置于倒置相差 显微镜下观察细胞外基质钙盐沉积情况、拍照。 Ⅳ 万方数据 博士学位论文7、成骨细胞诱导形成率计算：成骨诱导分化培养7、14、21及28 博士学位论文 7、成骨细胞诱导形成率计算：成骨诱导分化培养7、14、21及28 d，使用 甲醛固定细胞并用茜红素进行钙结节染色。在倒置显微镜下，两组随机取4个 100倍视野，用数码相机