metpla技术用于特定蛋白糖基化修饰的检测生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿态堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：壬蕊霞 签字日期： l叭b年弓月幺日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿态堂 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 厶1 学位论文作者签名： 王鬈霞 刷噬轹球蔽 乏、人f J 签字日期： ⅥI 5年≥月lg日 万方数据 致谢首先，我要感谢我的导师朱成钢副教授。刚进入实验室的我懵懂无知，朱老 致谢 首先，我要感谢我的导师朱成钢副教授。刚进入实验室的我懵懂无知，朱老 师安排师姐带我学习各项实验技能，然后给我分配小课题来锻炼我， 后来让我 与易文老师的团队合作完成一项课题。在这个过程中，我学到了很多知识，加 深了对自己专业的认识，也让我更加了解自己。当我在实验中遇到解决不了的问 题时，朱老师总是会给我非常有用的建议，让我茅塞顿开。每当我感到懈怠和灰 心丧气的时候，朱老师总会帮助和鼓励我，让我不断坚持和充满信心。感谢朱老 师对我的包容和理解，从您身上我看到了科研人的认真和毅力，也感受了到您对 待学生如同自己孩子般的亲切和关怀。能够成为您的学生，我感到万分幸运。 然后，我要感谢易文教授。虽然易老师没有直接指导我做实验，但通过雪霞 师姐间接受到了易老师的多次指导，受益匪浅。易老师能够准确把握课题的研究 方向和研究策略，他敏捷的思维和渊博的知识以及善良正直的为人都让周边的人 感到十分敬佩。易老师是我的榜样，是我未来奋斗的目标。 接下来我要感谢江学成师兄，帮我解答了很多实验上的困惑以及对我们如同 哥哥般的关怀；感谢周丽晓师姐，带我熟悉实验室的环境和教会我各项实验技能； 感谢李雪霞师姐，在完成课题的过程中耐心指导我和帮助我；感谢实验室的各位 师兄师姐师弟师妹们对我的帮助与支持，我们在一起就像家人一样和睦与融洽， 感谢大家一起度过的欢乐时光。 感谢我的家人一直以来对我的支持和鼓励。 万方数据 浙江大学硕士学位论文 浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 蛋白糖基化修饰是一种非常普遍的翻译后修饰，在调控蛋白稳定、折叠、运 输和功能等方面发挥重要作用。然而，检测细胞内特定蛋白糖基化的手段却非常 有限，在这里我们介绍一种通过结合糖代谢标记技术(glycanmetabolic tagging) 和原位邻位连接技术(111 situ proximity ligation assay,in situ PLA)来检测特定蛋 白糖基化的高效荧光成像技术一糖代谢标记邻位连接技术(Metabolic Tagging Proximity Ligation Assay,N匝TPL久)。 该技术是一种原位检测各种糖基化修饰的通用方法，并允许在细胞环境下观 察膜受体的二聚化现象。我们首先通过检测表皮生长因子(Epithelialgrowthfactor receptor,EGFR)的唾液酸化建立了METPLA技术，在显微镜下可以观察到实验 组和对照组荧光斑点信号数量有明显差别，证明了METPLA技术可以用于特定 蛋白糖基化的检测。接着，我们用METPLA技术检测了葡萄糖转运蛋白(glucose transporter type 4，GLUT4)以及它的糖缺失突变体GLUT4-N57Q上的唾液酸化 荧光信号，结果证明METPLA信号来自于同一个蛋白而非相邻蛋白上的修饰。 我们通过METPLA来标记唾液酸化EGFR并同时免疫染色不同细胞器来分析唾 液酸化EGFR的亚细胞定位。结果表明，METPLA不仅可以亚细胞定位糖蛋白， 并且有很高的空间分辨率。我们认为，当EGFR主要处在单体状态时，识别EGFR 胞外域(N一端)的抗体不能检测唾液酸化修饰的EGFR，但是利用识别EGFR胞 内域(C一端)的抗体则可以。为了验证我们的猜测，我们把A549细胞血清饥饿 过夜后加入EGF来诱导EGFR二聚化。随着EGF处理时间或剂量的增加， METPLA检测到的斑点状荧光信号也随之增加。我们通过抑制EGFR激酶活性 来证明METPLA荧光信号来自于EGFR二聚化而非二聚化导致的激酶活化。因 此，METPLA是一种检测E