雏鸭感染drv后炎性相关因子与脾损伤之间的动态关系基础兽医学专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文1．4．4透析袋的处理 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 1．4．4透析袋的处理 ．12 2试验方法 ．12 2．1 DuTNF．a多克隆抗体的制备 12 2．1．1 DuTNF．0c基因的PCR引物设计 12 2．1．2 RT．PCR对目的基因的扩增 12 2．1．3 PCR产物的回收 一13 2．1．4重组原核表达质粒的构建 ．14 2．1．5重组质粒的提取与鉴定 ．15 2．1．6重组蛋白的表达与鉴定 ．16 2．1．7重组蛋白的纯化与复性 ．17 2．1．8免疫方案 ．1 7 2．2多克隆抗体DuTNF．仅的鉴定 ．17 2．2．1间接ELISA检测血清免疫原性 17 2．2．2 DuTNF．Q在肝、脾免疫组织化学鉴定 ．1 8 2．3试验动物分组及处理 18 2．4试验样品的采集与保存 18 2．5感染JZ061214株DRV雏鸭的组织学病理变化动态观察 18 2．6鸭呼肠孤病毒及巨噬细胞在脾组织中的定位 19 2．7实时荧光定量RT—PCR检测雏鸭脾PKR介导的炎症信号通路相关因子及 炎性因子mRNA的表达量 20 2．7．1组织总RNA的提取 20 2．7．2引物的设计 ．20 2．7．3 RT．PCR扩增检测脾PKR、MKK6、AP．1和IPS．1基因 ．．21 2．7．4实时荧光定量PCR扩增目的基因 ．22 2．8脾脏中TNF．伐的免疫组化定量分析 一23 2．9数据分析 24 试验结果 ．25 l DuTNF—a多克隆抗体的制备 ．25 1．1 DuTNF．俚的克隆 ．25 万方数据 雏鸭感染ORV后炎性相关因子与脾损伤之间的动态关系1．2重组原核表达质粒的构建 雏鸭感染ORV后炎性相关因子与脾损伤之间的动态关系 1．2重组原核表达质粒的构建 25 1．3 DuTNF—位基因序列分析 26 1．4重组表达质粒pET一28a-TNF一0【的酶切鉴定 27 1．5重组菌的诱导表达产物鉴定与纯化 27 1．6重组蛋白的Western．bolt鉴定 28 2多克隆抗体的制各与反应原性检测 。29 2．1免疫兔血清抗体效价的测定 29 2．2免疫组化检测DuTNF．0t的反应原性 ．29 3雏鸭感染JZ061214株DRV的I临床表现与眼观病变 ．30 4 JZ061214株DRV感染雏鸭的组织学病理变化结果 31 5免疫组织化学技术检测脾病毒的组织分布 ．33 6免疫组织化学技术检测脾炎症反应 ．34 7实时荧光定量RT．PCR检测雏鸭脾PKR介导的炎症信号通路相关因子及炎性 因子mRNA的表达量 35 7．1实时荧光定量检测目的基因结果 35 7．2 RT．qPCR检测脾PKR、MKK6、AP．1、IPS—l、NF。心、TNF一姒IL．6的 mRNA表达量结果 。35 8 TNF—Ct在脾中的表达检测 一40 讨论 一42 l DuTNF一位克隆表达与多克隆抗体的制备 ．42 2 Jz株061214株DRV感染雏鸭的临床症状和脾脏病理变化的动态观察一43 3炎症反应在DRV引起脾损伤中的作用 43 3．1 DRV感染雏鸭后脾炎症反应检测 43 3．2 PKR介导的炎症信号通路在脾损伤中的作用 44 结论 一46 参考文献 。47 致谢 54 万方数据 雏鸭感染DRV后炎性相关因子与脾损伤之间的动态关系摘要 雏鸭感染DRV后炎性相关因子与脾损伤之间的动态关系 摘要 鸭呼肠孤病毒病是由鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus，DRV)引起的以脾表面 出现黄白色坏死灶，法氏囊萎缩为主要特征的一种急性传染病，该病毒可感染雏 鸭和鸡，继发感染其他病原引起动物死亡，给养殖业带来较大的经济损失。目前 关于哺乳动物脾损伤的机制研究已逐步深入，研究结果表明PKR在各种损伤过 程中发挥着重要作用。但是关于鸭PKR介导的炎症反应还未见报道，且是否参 与DRV引起脾损伤的进程还不清楚。因此研究PKR在脾损伤中的作用是很有必 要的。本研究通过建立人工感染模型，探讨PKR介导的炎症信号通路在DRV感 染雏鸭致脾损伤中的作用。主要包括以下几个方面： 1．DuTNF．Ⅱ多克隆抗体的制备 本实验以雏鸭脾组织的RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增DuTNF—n基因， 克隆至pET-28a载体上，经过BamH I和HindIII双酶切鉴定测序分析正确后，获 得重组质粒pET-28a-DuTNF—o【，转化至大肠杆菌Rosetta中，在IPTG终浓度 lmmol／L和37。C条件下诱导4h，外源基因获得高效表达。通过Ni柱对蛋白进行 纯化，纯化后的DuTNF．Ⅱ蛋白免疫新西兰大耳白兔，经三次免疫后取全血，分 离得到DuTNF．仅多克隆抗体。利用Elisa和免疫组织化学染色检测结果表