成纤维生长因子18对大鼠椎间盘髓核细胞凋亡及胞外基质的影响骨外科专业论文.docxVIP

温州医学院硕士学位论文成纤维生长因子1 温州医学院硕士学位论文 成纤维生长因子1 8对大鼠椎间盘髓核细胞凋亡及胞外基质 代谢的影响 中文摘要 目的：研究成纤维生长因子18对大鼠椎间盘髓核细胞凋亡的影响，观察成 纤维生长因子18作用于大鼠椎间盘髓核细胞外基质的变化，探讨其可能的机制。 方法：取2月龄SD大鼠，过量腹腔注射水合氯醛处死后取出椎间盘髓核， 单层培养大鼠原代腰椎间盘髓核细胞，取2代细胞进行实验，分为正常对照组、 血清饥饿组和成纤维生长因子18干预组。正常对照组培养基为高糖DMEM加10％ 胎牛血清，37。C常温C02培养箱中培养；血清饥饿组培养基为高糖DMEM，无血 清培养24小时；成纤维生长因子18干预组为血清饥饿组加入成纤维生长因子 18培养，余培养条件同正常对照组。CCK一8(Cell Counting Kit一8)检测各组 细胞活性；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检 测细胞凋亡，200倍荧光显微镜下拍片检测，细胞呈绿色荧光者为阳性凋亡细胞， 每张切片各选择3个视野，计算凋亡细胞数占细胞总数的百分比，即细胞凋亡 指数(Apoptotic Index)；免疫细胞化学法检测Cleaved caspase一3、 phospho．p38MAPK蛋白表达，细胞胞浆内棕黄色颗粒染色为阳性细胞，Image—Pro plus6．0医学图像分析软件测量阳性部位的吸光度(IoA)值，作为Cleaved caspase一3、phospho．p38川kPK蛋白的相对含量；RT—PCR(reverse transcript ion —PCR)检测Caspase一3 mRNA、Bcl-2 mRNA、p38MAPK mRNA、胶原蛋白II mRNA以 及蛋白多糖mRNA的表达，smart—view凝胶成像系统分析测量目的基因条带的吸 光度(IOD)与内参B—actin的IOD的比值作为各个样本的计量学指标。 结果： 1．CCK一8细胞活性检测示： 血清饥饿组与对照组比较，细胞存活率明显下降，p0．05；成纤维生长因子 18干预组与血清饥饿组比较，细胞存活率明显上升，p0．05。 2．Tunel检测凋亡指数(apoptosis index，AI)示： 血清饥饿组与对照组比较，细胞凋亡率明显上升(39．55±1．24；2．4±0．15)，p 0．01；成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比较，细胞凋亡率明显下降 (19．45±1．67；39．55±1．24)，p0．05。 3．免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白表达： 2 温州医学院硕士学位论文 温州医学院硕士学位论文 3．1血清饥饿组与对照组比较，cleaved caspase-3阳性表达细胞增多(20．12 ±3．29；4．64±0．39)，P0．05；成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比 较，cleaved caspase一3阳性表达细胞减少(11．15_+0．62；20．12±3．29)，P 0．05。 3．2血清饥饿组与对照组比较，phospho．p38MAPK阳性表达细胞增多(5．35± 0．25；10．41±0．33)，P0．05；成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比较， phospho．p38MAPK阳性表达细胞减少(8．11±O．21；10．41±0．33)，P0．05。 4．RT-PCR结果示： 4．1 Caspase一3 mRNA的表达：血清饥饿组与对照组比较，Caspase一3mRNA表达增 多，仄0．05：成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比较，Caspase一3mRNA 表达减少，仄0．05； 4．2 Bcl一2 mRNA的表达：血清饥饿组与对照组比较，Bcl-2 mRNA表达增多，仄 0．05；成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比较，Bcl-2 mRNA表达减少， 仄0．05； 4．3 p38MAPK mRNA的表达：血清饥饿组与对照组比较，p38MAPK mRNA表达增多， 仄0．01；成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比较，p38MAPK mRNA表达减 少，仄0．05； 4．4II型胶原蛋白mRNA的表达：血清饥饿组与对照组比较，II型胶原蛋白mRNA 表达增多，仄0．05；成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比较，II型胶原 蛋白mRNA表达减少，仄0．05； 4．5蛋白多糖mRNA的表达：血清饥饿组与对照组比较，蛋白多糖mRNA表达无显 著差异，pO．05；成纤维生长因子18干预组与血清饥饿组比较，蛋白多糖mRNA 表达无显著差异，pO．05