低氧诱导成骨细胞增殖分化两种机制的研究外科学骨外科专业论文.docxVIP

博士学位论文路，首先我们通过在缺氧状态下骨折断端血肿细胞中和巨噬细胞检测高迁移率 博士学位论文 路，首先我们通过在缺氧状态下骨折断端血肿细胞中和巨噬细胞检测高迁移率 族蛋白B1水平，并研究高迁移率族蛋白B1在常氧和缺氧环境中如何激发Toll 样受体的信号过程促进成骨细胞中的增殖规律。同时我们对在常氧和缺氧环境 下检测了成骨细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinsaes， ERK)和c．Jun氨基末端激酶(c．Jun N．terminal kinase，YNK)的磷酸化，并将XX． 特异性的siRNA转染到缺氧环境中的成骨细胞，并用高迁移率族蛋白B1干扰， 检测了细胞增殖特性和ERK／JNK的磷酸化。研究的第一部分主要探讨低氧下， 通过TLR．4信号通路高迁移率族蛋白B1(HMGBl)影响ERK／JNK磷酸化和成 骨细胞分化增殖的机制。第二部分我们要研究N．甲基吡咯烷酮在低氧环境下对 成骨细胞凋亡和分化的作用，并且从分子水平分析N．甲基吡咯烷酮对成骨细胞 作用的相关机制，本文的成果可能解释N．甲基吡咯烷酮可能促进低氧环境中成 骨细胞增殖分化修复骨折的能力，也为探索骨折不愈合的机制，研制治疗骨不 连的药物提供分子生物学基础。 研究目的 1、探讨低氧下，通过TLR．4信号通路高迁移率族蛋白B1(HMGBl)影响 ERK／JNK磷酸化和成骨细胞分化增殖的机制，为临床骨不连的治疗提供分子生 物学基础理论。 2、探讨低氧下，通过NF．rd3信号通路N．甲基吡咯烷酮(NMP)影响成骨细胞 分化的机制，为N．甲基吡咯烷酮的临床应用提供分子生物学基础。 研究方法 第一部分： 1．样本的制各及分组 选自2014年3月至2015年3月来自于内蒙古医科大学附属医院骨科31例 股骨干骨折病例，在手术前经患者签署知情同意书，经内蒙古医科大学附属医 llI 万方数据 摘要院医学伦理委员会伦理审核后，在手术中获取骨折周围血肿样本和新鲜血液样 摘要 院医学伦理委员会伦理审核后，在手术中获取骨折周围血肿样本和新鲜血液样 本。在RPMI．1640培养基中培养组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞，并在培养中 加入10％或2％的小牛血清，50}tg／ml的青霉素和50-tg／ml的链霉素，先对细胞 进行离心分离按照1．2×105活细胞／mL再悬浮，每三到四天更换新的培养液(依 据细胞生长的密度)。在RPMI．1640培养基中培养MG．63细胞，并在培养中加 入10％的小牛血清。50 I．tg／ml的青霉素和50 gg／ml的链霉素，将两类细胞在5％ C02，在37 oC的环境下放置于细胞培养皿上。低氧环境造模方法，将细胞在5％ C02和氮气及2％的氧气混合气体中培养。在高迁移率族蛋白B1检测试验中， 将组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞放置于常氧和低氧环境中培养8，12和24小时， 然后将悬浮组织细胞淋巴瘤细胞U937细胞收集，并进行高迁移率族蛋白B 1的 检测。在RPMI．1640(2％FBS)上培养85．95％细胞融合度的MG．63细胞，在常 氧和低氧环境下混合0，0．2或者l J，tg／mL高迁移率族蛋白B1培养24，48和72 小时；将siRNA．TLR．4和control siRNA混有30和60 nM脂质体2000(Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)转染MG．63细胞造模敲除MG．63细胞的TLR．4。 2．高迁移率族蛋白B1的酶联免疫吸附试验 为了检测骨折断端血肿样本和新鲜血液样本中以及巨噬细胞U937的高迁移 率族蛋白B1的水平，按照酶联免疫吸附试验说明书的步骤进行操作检测，实验 板孑L中连续滴加100皿标准液和样本，并在37。C环境下孵育2小时，然后吹 吸样本，然后用100山混有PBST的磷酸盐溶液冲洗四次，然后将100 laL高迁 移率族蛋白B1抗体加入孔中，37摄氏度下孵育一小时，冲洗四次，每孔再加入 lOOpL螯合有辣根过氧化物酶的二抗37摄氏度下孵育30分钟，在黑暗环境下每 孔加入100pL的终止液并放置15分钟，封板后在450nm酶标仪中测量数据。 3．mRNA的提取和定量分析 MG一63的mRNA用TRizol reagent试剂盒进行提取，mRNA的含量用实时 定量PCR仪进行测量，MG．63细胞中的ERK，JNK，TLR．Tubulin的mRNA含 量用SYBR Green PCR Kits试剂盒进行定量检测，定量聚合酶链反应(quantitative IV 万方数据 博士学位论文polymerase 博士学位论文 polymerase chain reaction，qPCR)过程在ABI PRISM 7300检测系统中进行，引 物链是由上海生工公司合成，所有的检测