p66shc对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响及机制研究消化病学专业论文.docxVIP

博士学位论文Bad来促进细胞的生存。Bad是Bcl—2家族中的一个促凋亡蛋白，它通过结合 博士学位论文 Bad来促进细胞的生存。Bad是Bcl—2家族中的一个促凋亡蛋白，它通过结合 和拮抗Bcl．2来促进细胞凋-亡(Apoptosis)。地能直接使Bad与胞质中的蛋白螯 合，从而终止Bad在线粒体膜上对Bcl．2的拮抗作用，使得被释放后的Bcl．2，恢 复抗细胞凋亡的功能。最近的研究提示，Akt通路通过Mdm．2．p53功能通路参与 细胞周期的调节，众所周知，p53是经典的抑癌基因，然而当Mdm．2以单体形式 进入细胞核后可与p53结合，促进其降解，因此Mdm．2可以抑带1]p53的功能，从 而进一步影响细胞周期的进行，然而Mdm．2是Akt的下游作用底物，因此推测 P13K／Akt／Mdm．2／p53通路是一条调节细胞周期的重要通路。众多的研究表 明，P13K／Akt通路在多种恶性肿瘤组织中被激活及过表达，诸如胃癌、乳腺癌、 胰腺癌等，P13K／Akt通路能够抑制许多肿瘤抑制蛋白的表达，诸女1]Bad，FOXO 转录因子等，Akt可以通过磷酸化作用活化Bad，活化后的Bad与Bcl．2解离，从 而使Bcl．2发挥抗凋亡作用，因此，阻断P13K／Akt通路可能对于抑制肿瘤细胞 增殖、促进其凋亡有重要意义。在关于乳腺癌、前列腺癌的研究中表明，p66Shc 参与了细胞的线粒体介导的细胞凋亡过程，多数报道认；)kgp66Shc通过氧化应激 过程参与了肿瘤细胞抗凋亡过程，在我们的前期实验中表明，p66Shc有促进结 直肠癌细胞增殖及抗凋亡作用，而且预实验结果提示p66Shc的表达水平与Bcl．2 蛋白家族、蛋白水解酶存在相关关系，因此提出假说考虑p66Shc的通过P13K／ Akt／Mdm．2／p53通路参与调控结直肠癌的增殖和凋亡过程。在我们的实验研究 中，首先检测验i正Tp66Shc在结直肠癌组织及结直肠细胞株中的表达水平，其 次通过干扰其表达进一步研究p66Shc沉默后对结直肠癌细胞的增殖、凋亡的影 响，最后检测P13K，Akt，Mdm．2／p53通路中的凋亡相关蛋白的表达变化，旨在探 讨p66Shc对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响及信号调控通路的调控机制，为临 床干预进展期结直肠癌的增殖、凋亡提供理论实验基础。 研究方法 1．p66Shc在结直肠癌组织及细胞株中的表达 III 万方数据 摘要采用实时定量PCR技术(RT-PCR)与免疫印迹(Western 摘要 采用实时定量PCR技术(RT-PCR)与免疫印迹(Western blot)技术检测 30例结直肠癌组织和癌旁组织中p66Shc的表达。检测细胞株(NCM460、 HCT8、HCTll6、SW620、CaC02)中p66Shc的表达水平。(NCM460是 正常结肠上皮细胞，其余四株是结直肠癌细胞)。 2．干扰结肠癌细胞株HCT8中的p66Shc的表达 (1)利用生物信息在线网站Ambion、Genesil、Genecard设计RNAi序列。 (2)生物技术公司合成si．p66Shc，运用RNA干扰技术沉默HCT8中的p66Shc 的表达。 (3)RT-PCR、Western blot技术检测干扰效果。 3．干扰p66Shc的表达对结直肠细胞增殖、凋亡的影响 (1)运用CCK．8细胞增殖实验，检测干扰p66Shc对HCT8细胞增殖的影响。 (2)运用流式细胞技术AnnexinV-FITC方法，检测干扰p66Shc对HCT8细胞 凋亡的影响。 4．p66Shc调节结直肠癌细胞信号通路的初步研究 (1)干扰p66Shc对结直肠癌细胞中凋亡相关蛋白的影响 运用Westem blot法检测HCT-8干扰后的细胞中细胞凋亡蛋白caspase．3、 caspase．9、Bax、Bcl．2的表达变化。 (2)干扰p66Shc对P13K．AKT信号通路相关蛋白的影响 运用Western blot法检测干扰后p-P13K、P13K、p-AKT、AKT、p-Mdm一2、 p53表达变化。 5．流式细胞仪检测干扰p66Shc后对HCT-8细胞周期的影响 6．统计学方法 研究中所有数据均采用SPSSl3．0统计学软件进行统计学分析。定量数值采 用均数士标准差(standard deviation，SD)表示。其中组织的RT-PCR结果△Ct 的比较采用配对样本t检验(Paired．Sample t text)。实验过程中RT-PCR实验结 果采用单因素方差分析(One．Way ANOVA)法进行统计分析。CCK-8体外增 IV 万方数据 博士学位论文殖实验采用方差分析和单因素方差分析法进行分析。所有统计学结果P0．05 博士学位论文 殖实验采用方差分析和单因素方差分析法进行分析。