实验报告(硫酸铵法实验报告例).docVIP

《生物技术制药概论》综合性实验 “动植物超氧化物歧化酶SOD的制备” 背景介绍：超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD) “J能与机体衰老、肿瘤发牛、自 身免疫疾病和辐射防护有关，是一种重要的蛋白质类药物，可用于炎症、类风湿关节炎、慢 性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等。SOD存在于动、植物、微生物中，冇 Cu-Zn-SOD,Mn-SOD,Fe-SOD等多种形式存在。植物SOD的研究今年来引起了科学家的特 别重视，因为SOD具有清除体内过量的超氧自山基(Of)的功能，対于预防衰老、血管硬 化等有显著效果，对疾病的治疗也初步显出疗效；植物来源的SOD稳定性较动物来源的好, 特别是类?SOD,因相对分了量较小，易透性好，引起保健品、美容品方面的特别重视。比 较好用的品种有刺梨、茶叶等植物的SOD。此外，植物SOD酶在农业新品种培育研究小也 有重要意义。 该综合性实验涉及木科程动物细胞制约、植物细胞制药及酶工程制约。实验过程综合了 药物制备的重要步骤，如：收集、植物干粉制备、丙酮抽捉、清洗、溶血、去血红蛋口、沉 淀、热处理、分离、透析浓缩、蛋片质类药物的纯化技术、酶类药物的活性测定等。 一、 实验目的 通过本实验学习，使学生掌握牛物技术制药的重要章节：动物细胞制药、植物细胞制药、 酶工程制药，提高学牛运用知识、对理论知识的应用等综合能力。 二、 实验原理 将动植物材料用不同的方法进行细胞破裂后用缓冲液浮洗，再用乙醇、氯仿去除杂质沉 淀，在硫酸钱、丙酗作用下使SOD沉淀；最后进行溶解，并用透析、柱层析(DEAE-Sephadex A50;Sephadex G-100;DEAE-cellulose)的方法进一步纯化，得到 SOD 纯品。 三、 实验步骤 3.1实验材料： 新鲜桑叶、硫酸谡、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 3.2实验步骤： 新鲜桑叶［制干粉］丙酮 ［提取］ 桑叶丙酮干粉 新鲜桑叶 ［制干粉］ 丙酮 磷酸钾缓冲液 I— 丙 ［沉淀酶］酗 ［透析，浓缩］ 1 ［柱层析］活性组分 ［柱层析］ 活性组分 Sephadex G-100 梯 度 DEAE-Cellulose 洗 ［离子交换］ 脱 浓缩酶液 超滤浓缩 PH7.8磷酸钾缓冲液 SOD纯品桑叶SOD SOD纯品 A、粗提 （1） 桑叶T大量清水洗涤T-净一＞蒸係水洗涤一＞滤纸吸干称50g-＞研磨机研磨T过滤一＞ 上清液-测定体积（V1） （2） 上清液-＞60°C水浴20min （去杂蛋白）-＞10000r/min冷冻离心20min -＞上清液一＞ 测定体积（V2） B、纯化（硫酸铁分级沉淀法） 按A的体积查岀0C达到一淀饱和度需加入的硫酸钱的质量 50%饱和度I上清液I90%饱和度I 50%饱和度 I 上清液 I 90%饱和度 I 沉淀 10000r/min 20min 4 °C 10000r/min 2h 20min solution blank control sample PH8.3PBS 4.7ml 4.7ml 4.5ml HC1 10gl SOD sample 0.2ml 邻苯=酚50mmol/L lOpL 10gL V总 4.7ml 4.7ml 4.7ml 5mmol/L PH7.8PBS C、按表中试剂用量加入试管并在25°C保温25mino 注：缓冲溶剂的配置根据附表的相关浓度进行 D、活力测定: 将样品溶液倾入1 cm的比色杯中，在325 nm处每隔30 s测定吸光度1次，选择吋间范围, 控制对照管每分钟吸光度的变化速率在0.070左右，记录样品溶液每分钟 。 E、酶活力的计算： SOD 活力（U-mg-1 ） = （0.070 - AA325 ）x100 % xV 总-0.070 x50 %-V 定义?V 样。 其中:V总代表反应总体积， V样代表加入样品液的体积， V定义代表活力单位定义体积（1 ml） o 四、实验数据和实验结果 1、 称取桑叶重量：50.1246g VI： 40.80ml0.711 倍V2 VI： 40.80ml 0.711 倍 V2：未测出 未测出 即可根据测岀值计算AA325 即可根据测出值计算AA325 （1） 实际加入缓冲液体积：70ml （2） 分别稀释倍数： （3） 测定前再稀释倍数：耒知 3、酶活力测定获得两组数据： xl x2 x3 x4 （未测岀） xl x2 x3 x4 （未测出） 将以上数据带入公式：SOD活力(U-mg-1 ) = (0.070 - AA325 ) xlOO % xV总一0.070 x50 %-V定义?V样，即可得到桑叶中SOD的酶活力。 五、实验结论及心得 (-)实验结论 1、 木次实验由于实验仪器的故障问题(离心机破损)导致实验最终无法顺