eb病毒潜伏膜蛋白1胞外区融合蛋白的表达及其在血清学检测中的应用耳鼻咽喉头颈外科专业论文.docxVIP

南京医科大学硕士学位论文EB病毒潜伏膜蛋白l胞外区融合蛋白的表达 南京医科大学硕士学位论文 EB病毒潜伏膜蛋白l胞外区融合蛋白的表达 及其在血清学检测中的应用 中文摘要 鼻P因癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是鼻咽上皮来源的恶 性肿瘤，在我国南方具有很高的发病率，对NPC的血清学和组织活 检及EB病毒(Epstein．Barr Virus，EBV)的基因表达检测都表明：EB 病毒不仅与鼻咽癌的发病密切相关，而且对其发生发展起重要作用。 EB病毒潜伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein 1,LMP．1)能够 在鼻咽癌患者的鼻咽拭子分泌物检测到。临床研究中，应用PCR技 术检测鼻咽拭子分泌物诊断鼻咽癌，其灵敏度和特异度分别为94．5％ 和100％。LMP．1在EBV致瘤机制中发挥关键性的作用：它能使B 淋巴细胞永生化和鼠纤维母细胞的细胞形态改变；在Rat．1细胞上， LMP一1使其血清依赖性降低、接触抑制和粘附作用丧失，接种裸鼠内 可形成肿瘤。LMP．1在鼻咽癌细胞普遍表达，并与鼻咽癌的进展呈正 相关，因此，LMP．1在鼻咽癌的形成中具有重要的生物学意义。 基于疫苗技术的发展，EBV特异性的CD8细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocytes，CTL)被认为是治疗EBV相关的鼻口因癌 (NPC)和复发性霍杰金病(HD)首选方案。EBV表达的LMP．1与 LMP一2是仅有的两种适合于治疗性强化NPC和HD患者CTL反应的 目标抗原。因此，为了增强其抗原性，本研究选用了LMP．1胞外区作 为目的蛋白进行原核表达，为进一步制备LMP一1抗体制备及研究 南京医科火学硕士学位论文LMP一1的生物学活性奠定基础，同时抗原也有望应用于临床检测。 南京医科火学硕士学位论文 LMP一1的生物学活性奠定基础，同时抗原也有望应用于临床检测。 方法： 1．合成LMP。l胞外区蛋白核酸序列； 2．用BamH I和眈出I将含LMPl胞外区重组基因的质粒 pMDl8一LMPl双酶切后，将胞外逸片段克隆到pGEX一4-2中； 3．重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌BL21 (DE3)，以异丙基硫代．岱-D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合 蛋白； 4．表达的蛋白经谷胱甘肽S．转移酶柱亲和层析纯化； 5．收集鼻咽癌患者的血清； 6。纯化的蛋白经Western blot法检测鉴定； 7．ELISA方法检测17位鼻咽癌病人血清中抗体。 结果： 1．重组表达质粒pGEX．LMPl经酶切鉴定为阳性，核酸序列分析 正确。 2．SDS．PAGE和Western blot结果显示表达的重组蛋白分子 GST-LMP。l胞外区融合蛋白分子质量约为32．2ku。 3．Westem blot结果表明此抗原能够与鼻咽癌患者血清中抗体特 异性结合。重复实验三次，共检测了王7份临床上确诊的NPC 患者，其中的13份可检测出针对重组蛋白的抗体，而lo份健 康人血清未检出抗体，检出率76．5％。 4．ELISA方法检测鼻咽癌病人血清中抗体。重复实验三次，共检 测了17份临床上确诊的NPC患者，其中的ll份可检测出针 4 南京医科大学硕士学位论文对重组蛋白的抗体，而10份健康人血清未检出抗体，检出率 南京医科大学硕士学位论文 对重组蛋白的抗体，而10份健康人血清未检出抗体，检出率 64．7％。 结论： 成功制备LMPl胞外区重组基因表达的蛋白，并证明原核表达 的LMPl胞外肽段保持了原有的抗原性，能够与EBV相关鼻咽癌患 者血清中的抗体特异性结合。 关键词： 鼻咽癌；EB病毒；LMPl(潜伏膜蛋白1)；胞外区；免疫学 检测 南京医科火学硕士学位论文Expression 南京医科火学硕士学位论文 Expression and Purification of GST-·LMP-—1 Extracellular Domain Fusion Protein of EB Virus AB STRACT Nasopharyngeal carcinoma fNPC)is malignant tumor derived from nasopharyngeal epithelium cell．Its incidence is hi。gh in certain regions such as south-east Asia，especially in the south of China．The serum detection of EBV infected patients and tissue biopsy have been provided insight to the contribution of EBV an