第三章 高效液相色谱分析.ppt

第三章 高效液相色谱分析 高效液相色谱法 是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。 原则上只要能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱法分析，尤其适合那些不宜用气相色谱法分析的难挥发性物质、热不稳定物质、离子型物质和生物大分子等。在目前已知的有机化合物中，有80％的有机化合物能用高效液相色谱法分析。 §3-1高效液相色谱分析法的特点 一、高压 一般供应压力1.5—3.5×104Kpa (为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm）， 液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。) 二、高速 移动相流速可达1—10ml/min，在分析柱内线速度为3cm/s以上，接近于气相色谱中的载气速度 三、高效 具有高的分离效率和分辨本领，柱效可达3万—10万 四、高灵敏度 主要采用了基于光学原理的检测器，如紫外、荧光检测器，最小检测量分别为10-9g、10-11g 五、测定样品范围广 只有15%-20% 的低沸点、低分子量（400）、热稳定性好的化合物可用气相色谱法分离，其余的有机物原则上都可用HPLC分离、分析。 但是，设备昂贵，柱填充剂和流动相也比GC贵 §3-2影响色谱峰扩散和色谱分离的因素 气相色谱分离的基本理论同样适用于液相色谱，但由于HPLC和GC 的流动相不同，两者有些差异。 速率方程式为: H=He + Hd/μ+（Hs+Hm+Hsm）μ 一、涡流扩散相He（GC为A） He=2λdP λ、dP的含义与GC中相同，可见均匀、细小的颗粒填料，装柱严密均匀在HPLC中同样必需。HPLC的填料粒径为3—10μm 二、分子扩散相（纵向扩散相）Hd/μ（GC为B/μ） Hd=CdDm Cd为一常数，Dm 扩散系数（组分在流动相中） 由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4—5个数量级，Dm与黏度有关,η大, 扩散慢，Dm小， η小, 扩散快, Dm大。 所以，当μ≥0.5cm/s，Hd的影响小且恒定。这是HPLC与GC的很大不同点。 三、传质阻力项 Hs+Hm+Hsm （GC中为C） Hs——固定相传质阻力；Hm——流动的流动相传质阻力；Hsm——滞留的流动相传质阻力，是增加传质阻力的最大影响因素。 故改进固定相的结构 是提高液相色谱柱效的重要问题。 Hs=Csdf2/Ds Hm=Cmdp2/Dm Hsm=Csmdp2/Dm Ds与Dm一样，均与液体粘度有关，η↗，Ds、Dm则小，可见，与GC类似，小的颗粒、填料、薄的液膜厚度，低粘度的液固相都有利于传质，提高柱效。 综上所述 HPLC中影响柱效的主要因素是传质项，分子扩散项很小，HPLC的H—μ曲线及与GC的H—μ曲线比较见下图。 HPLC的H—μ曲线与GC的H—μ曲线 HLPC的典型H-u图 是一段斜率不大的直线，无最佳点，μ↗对H的影响也不会很大。 之外，进样（进样器死体积、进样点）、柱后连接管的体积、检测器 的死体积都可导致色谱峰扩展（柱 外展宽）。 §3-3高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，HPLC 可分为四种基本类型： 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 尺寸排斥色谱。 具体包括： 液液色谱法（LLC），包括正相、反相（两相极性相反）、化学键合相（CBC）； 液固色谱法（LSC）； 离子交换色谱法（IEC）； 离子色谱法（IC）； 离子对色谱法（IPC）； 空间排阻色谱法(SEC), 包括： （1）GFC 凝胶过滤色谱，水为流动相 （2）GPC 凝胶渗透色谱，非水做流动相 一、LLC和化学键合相色谱 K=Cs/Cm=kVm/Vs GC中K主要决定于组分和固定相的性质HPLC中流动相也有很大影响力，k值大的R值大。 LLC的三种类型 1）正相LLC 流动相极性＜固定相极性 2）反相LLC 流动相极性＞固定相极性 3）化合键合相色谱（担体与固定液之间化学键合为共价键，产生化合键合固定相，[如 ≡Si-O-C≡N等] 优点：防止固定液流失。 LLC 分离原理：基于试样组分在两相的溶解度的差异。组分在固定相和流动相上的分配。 最适用于同系物的分离。 二、LSC 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；根据物质吸附作用的不同来进行分离的。 其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分子（S）在吸附剂活性表面的竞争吸附 Xm+nSa＝Xa+nSm a—吸附剂中 K=[Xa][Sm]n/[Xm][Sa]n m— 流动相中 LSC 组分在吸附剂中的浓度大或溶剂分子在流动相中的浓度大，都导致K大，tR大 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和