分枝杆菌同源重组系统的构建及应用微生物学专业论文.docxVIP

摘要分枝杆菌属包括致病性结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，目前仍然是人类健康 摘要 分枝杆菌属包括致病性结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌，目前仍然是人类健康 的巨大威胁。分枝杆菌的科学研究都需要有效的分子遗传操作技术，尤其是快速 有效的基因突变及基因敲除的分子操作技术。但是由于分枝杆菌生长缓慢、重组 酶活性较低等原因，在分枝杆菌内的基因操作技术包括基因敲除技术的发展一直 落后于其他模式生物。我们在Xer／dif敲除系统的基础上开发了一种高效、通用、 完善的基因敲除系统。我们在pJV53质粒中引入gfP报告基因，用于快速筛选在 重组后丢失的质粒；构建了出产胁冒一出‘dif-zeo—dif表达盒，在表达盒两边 加了多克隆酶切位点便于上下游同源臂的插入；随后我们利用该系统对耻垢分枝 杆菌的4对毒素一抗毒素基因进行了连续的读码框内敲除，表明该系统可成功用 于分枝杆菌多基因的连续敲除，为分枝杆菌功能基因组的研究提供了新的遗传工 具。 我们对结核分枝杆菌中的毒素一抗毒素系统进行了初步的研究，新发现了6个 在耻垢分枝杆菌中有功能的毒素一抗毒素基因。此外，我们发现12个毒素一抗毒 素基因在耻垢分枝杆菌中具有稳定质粒的功能，这说明它们可能参与调控结核分 枝杆菌基因组的稳定。该研究为进一步研究毒素一抗毒素系统在结核分枝杆菌中 的功能打下基础。 关键词：分技杆菌，基因敲除，毒素一抗毒素系统 万方数据 AbstractGenus,仃ycobacterium,including Abstract Genus,仃ycobacterium,including the pathogeniC species tuberculosis and 7eprae，remains a huge threat to human health．Both scientific study and medical contr01 of mycobacteria require effiCient molecular toolS for genetic manipulation，especially directed mutagenesiS and gene deletion． However，due to the slow growth of the Mycobacterium，the low recombinase activity，genetic manipulation techniques，including gene knockout technology development has been lagging behind other model organisms．In thiS study，we developed an effieient，versatile and improved deletion system based on the Xer／dff knockout system．We modified pJV53 plasmid by introducing a gfP gene for rapi d screening of recombinant．We al SO created dif—flanked Zeo—and Hyg—resistance cassettes containing multiple restriction enzyme sites for homology arms inserted．We tested thiS system by using it to sequentially delete four pairs of toxin—antitoxin(TA)genes in MycoDactoriUm smogmatis．ThiS system provides a new genetiC tool for the study of functional genomiCS of Mycobacterlum． We further systematically analyzed the TA genes of彬vcobacterium tuberculosis i n膨smegmatfs and identified six new functional TA genes． In addition，we found 12 TA genes increase the plasmid stability。 indicating these genes might be involved in chromosome stability of ft． tuberculos，．9． Keywords-Mycobacterium，gen