溃疡性结肠炎患者外周血调节性t细胞功能状态的研究内科学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 ·中文论著摘要 ·中文论著摘要· 溃疡性结肠炎(UC)患者外周血 调节性T细胞功能状态的研究 ．▲上．-JL 刖 吾 炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一组累及胃肠道的自身免疫 性疾病，包括溃疡性结肠炎(uclerative colitis，UC)和Crohn病(Crohn’S disease，CD)。近年来，炎症性肠病(IBD)尤其是溃疡性结肠炎的发病率呈逐年上 升趋势。其病因、发病机制目前仍不明确，认为与免疫、环境、感染及遗传等多种 因素相互作用有关，其中免疫因素在IBD发病中起着重要作用，且已成为研究热 点。 炎症性肠病由过强的免疫反应所介导，T淋巴细胞在其中起重要作用，但T 胞介导的免疫失耐受机制不很清楚。机体内存在以抑制免疫反应为主要功能特点 的较独立的CD4+T淋巴细胞亚群(现倾向于称为调节性T淋巴细胞，Treg)，其 中CD4+CD25+T细胞是目前所认识的最重要的一群，调节性T淋巴细胞／致病性T 淋巴细胞平衡是机体调节免疫反应的重要模式之一，其紊乱可能是很多自身免疫 性疾病的发病机制【I】a过强的免疫反应可由致病性T细胞(促炎促免疫T细胞) 原发性功能增强引起，也可能由调节性T细胞免疫抑制功能原发性下降所引起。 研究调节性T细胞在病人机体内的功能状态，回答炎症性肠病的发病是否与调节 性T淋巴细胞的抗原特异性免疫抑制功能缺陷有关是值得尝试的【2】。 从正常人和UC患者外周血中收集并分离淋巴细胞和单核细胞，用自体肠道 菌群制作成抗原，在体外培养中刺激淋巴细胞，然后检测代表调节性T细胞的表 型CD25、CDl52、CD45RB(CD45RO)，转录因子FOXP3，以及细胞因子IL．6、 TNF．0【、IL．10、IFN-y和IL．4等，能够初步的评介出调节性T细胞的在UC中的 数量及功能状态。 材料与方法一、材料 材料与方法 一、材料 研究对象均来源于于中国医科大学盛京医院内镜中心做电子肠镜检查者。对 照组15例，男8例，女7例，年龄20．57岁，平均36岁；溃疡性结肠炎(UC) 组23例，男14例，女9例，年龄16．55岁，平均33岁。 二、主要试剂及仪器 Human Regulatory T Cell Staining Kit，CD4(7E 1 4)一FITC／CD25(1 T1Ⅳ)一PE Cocktail，抗人CD45RO(UCHLl)／Biotin和CDl 52／Biotin，ELISA Kit，考马斯 亮蓝总蛋白定量试剂等。流式细胞仪、低速低温离心机、C02孵箱、超声细胞破 碎仪、酶标仪、可见光分光光度计等 三、淋巴／单核细胞分离 用肝素抗凝管采外周血10mL，10min内用RPMll640(含lOmmol／L HEPES，100kU／L青霉素、30medL庆大霉素)10mL稀释后加入2个15mL离心管， 用连接6号加长针头的注射器抽Lympholyte—H(1．077 kg／L)，每管4mL缓慢加在 稀释血液下面，1200r／min离心20min，取灰白层单个核细胞悬液，PBS洗2次， 用5mL RPMll640(含100mL／L胎牛血清，HEPES及双抗)混悬细胞，将低密度 Percoll(1．068kg／mL，335mmol／L)4mL和高密度Percoll(1．080 kg／mL，335mmol／L) 2mL分层铺在细胞悬液下面，2000 r／min离心15rain，取低密度Percoll中段以上 及至高密度Percoll中段的细胞悬液，分别作为单核细胞和淋巴细胞，PBS洗2次， 苔盼蓝染色计数活细胞均在96％以上，取细胞悬液作离心涂片，Wrights—Giemsa 染色鉴定，淋巴细胞和单核细胞的纯度分别在97％和90％以上。 四、肠道菌群抗原的制作 肠镜下取大肠标本，将其表面所带细菌接种到50ml疱肉培养基中，液体石蜡 封闭，370C培养48小时，离心、超声破碎及考马斯亮蓝法测细菌抗原总蛋白浓 度。 五、细胞培养 2 培养基为约含10 培养基为约含10％自身血浆的RPMI-1640，滤除去血小板，用含双抗(100u／ml 青霉素+30ug／ml庆大霉素)、10mM HEPES及0．05raM fl-ME的RPMI-1640稀释 后作为完全培养基。单核细胞以1×105个／孔加入96孔板，并以20ug／ml加入自身 来源的肠道厌氧菌群抗原，对照孔不加细菌抗原，16小时后每隔2小时半量换液 一次，共4次，以稀释除去细菌抗原，然后按8x104／孑L加入自身的淋巴细胞，隔 天半量换液一次。 六、流式细胞术 分离第2天及混合培养第14天的淋巴细胞用于流式细胞检测CD4、CD25、 CD45RO、CDl52及FOXP3的表达，操作按照