睾丸sertoli细胞免疫豁免机制的研究及对大鼠同种心脏移植的影响胸心血管外科专业论文.docxVIP

睾丸Se本课题来源：广东省自然科学基金，项目编号990386； 睾丸Se 本课题来源：广东省自然科学基金，项目编号990386； 广东省医学科研基金，项目编号A1999326； ．广州军区武汉总医院科研基金，2005年度。 免疫豁免概念的提出已经有一百多年的历史，机体的某些器官，如脑、眼、 角膜、卵巢、胎盘等，不受免疫系统的干扰和排斥，称为免疫豁免器官。对免 疫豁免机制的研究，有可能找到使移植的细胞、组织和器官突破同种甚至异种 移植免疫屏障的新方法，具有广阔的临床应用前景和潜在的巨大经济效益；加 强对免疫豁免机制的研究，将使器官移植摆脱免疫抑制剂的束缚，而使病人长 期存活。 ．国内外目前对睾丸支持细胞(Sertoli cells，Sc)免疫豁免机制的研究才刚刚 起步。初步研究发现睾丸Sertoli细胞能产生细胞因子FasL(Fas的配体，属肿 瘤坏死因子家族)和TGF．Bl(Transforming Growth Factor-61，转化生长因子B1)， 这两种细胞因子可能与睾丸Sertoli细胞产生免疫豁免功能有关。因此我们开展 了对睾丸Sertoli细胞免疫豁免机制的进一步研究，并探讨Sertoli细胞对同种心 脏移植免疫排斥反应及细胞凋亡的影响。 本研究目的： 1、探讨睾丸Sertoli细胞分离纯化方法，检测睾丸Sertoli细胞FasL、TGF．B 1 的表达率； 中文摘要2、将Sertoli细胞与异基因T淋巴细胞共同培养，观察Sertoli细胞对异基因 中文摘要 2、将Sertoli细胞与异基因T淋巴细胞共同培养，观察Sertoli细胞对异基因 T淋巴细胞的毒性作用； 3、观察Sertoli细胞对异基因T淋巴细胞凋亡的影响； 4、制作同种异体大鼠腹腔异位心脏移植动物模型，在移植心脏种植与供心 同基因Sertoli细胞，掌握制作大鼠腹腔异位心脏移植动物模型的外科技 术； 5、对种植Sertoli细胞的移植心脏与未种植Sertoli细胞的移植心脏，比较两 组急性排斥反应(Acute Rejection，AR)、心肌细胞凋亡指数(Apoptosis Index，AI)、心肌内Fas(Factor associated suicide，自杀相关因子，又 称CD95或APO．1)mRNA、FasL mRNA、TGF-13 1 mRNA的表达，并 进行相关分析，明确Sertoli细胞对心脏移植免疫学影响，探讨Sertoli细 胞对同种异体移植心脏是否具有免疫豁免作用。 实验一、Sertoli细胞的分离纯化及其免疫豁免机制的研究 一、目的 1、探讨大鼠睾丸Sertoli细胞分离提纯方法，检测Sertoli细胞FasL、TGF． 13 1的表达百分率； 2、将大鼠睾丸Sertoli细胞与异基因T淋巴细胞共同培养，观察Sertoli细 胞对异基因T淋巴细胞的毒性作用； 3、观察大鼠Sertoli细胞对共同培养的异基因T淋巴细胞凋亡的影响。 二、方法 1、Wistar大鼠Sertoli细胞的制备 取2～3周龄雄性Wistar大鼠的睾丸(生精细胞小于5％)，消化酶消化， 500um筛网过滤后， 39C(在此温度去除生精细胞)5％c02条件下孵育 48小时后，除去损伤的细胞，获得高纯度的Sertoli细胞。 2、SD大鼠T淋巴细胞制备 n 博士学位论文取SD大鼠脾脏，于200目金属网研压，收集细胞悬液，用大鼠淋巴细 博士学位论文 取SD大鼠脾脏，于200目金属网研压，收集细胞悬液，用大鼠淋巴细 胞分离液和尼龙毛柱法分离出高纯度T淋巴细胞。 3、免疫组化SABC法检测Wistar大鼠Sertoli细胞FasL、TGF．13 1的表达。 4、不同数量的Wistar大鼠Sertoli细胞对SD大鼠T细胞的毒性作用 取96孔培养板，每孑L／JH入靶细胞 ．SD大鼠T细胞lxlos个(100u1)， 每-孑L／Jn植物血凝素(Phytohemag舀utinin，PHA，具有促进T细胞增殖的功 能)20u1(20 me／L)，再加经15戈瑞(Gray，Gy)照射1h的效应细胞 一Wistar 大鼠Sertoli细胞(15 Gy辐射使细胞失活)。根据效应细胞和靶细胞的 比值分成To～15 6组，效靶比依次为0／1、0．001／1、0．01／1、0．1／1、1／1、 10／1； T0组：T细胞+Sc细胞O个(100／zL)+DMEM／F．12培养基10叫L； Tl组：T细胞+Sc细胞lxl03／ml(100BL)+DMEM／F．12培养基10吮L； T2组：T细胞+Sc细胞lxl04／ml(100pL)+DMEM／F．12培养基10陬L； T3组：T细胞+Sc细胞lxlOS／ml(100pL)+DMEM／F．12培养基10毗L；