人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定外科学整形专业论文.docxVIP

学位论文独创性声明本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 学位论文独创性声明 本人呈交的学位论文系在导师指导下所取得的研究成果。除了文 中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，也不包含)-b获得广东医学院或其他教育机构的学位或 证书所使用过的材料。 作者签名：益薄日期：兰塑蚪 学位论文知识产权声明 本人在就读研究生期间所完成的学位论文及其相关成果，知识产 权归属学校。本人在毕业离校前会将有关的研究资料和结果全部上交 导师，离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时，署名单位仍然为广东医学院。学校可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文，可以公布(包括刊登)论文的全部或部 分内容。导师享有发表学位论文、申请成果和专利的权利。 注：保密的学位论文在解密后适用本声明。 作者签 日期：2生垒翌：笸二二f 导师签 日期：．Z翌堕二箜二三； 人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 中文摘要 【目的】 病理性瘢痕包括增生性瘢痕与瘢痕疙瘩，其形成过程受到各种因素的影响。 一般认为它们是由创伤引起，以成纤维细胞的过度增生及胶原等大量细胞外基质 的过度产生和沉积为特征的皮肤纤维增生性疾病。病理性瘢痕的发病机理至今不 甚清楚，但以往大量研究表明瘢痕的过度增生与细胞因子、癌基因和免疫反应等 密切相关。越来越多的研究表明人白介素24(interleukin 24．IL一24)具有重要的 免疫系统调节功能，对肿瘤细胞具有选择性生长抑制和诱导凋亡作用。重组腺病 毒载体是目前应用最广泛的生物病毒载体之一，与其他病毒载体系统比较，具有 明显优点：能将外源基因高效导入哺乳动物细胞；其转染不依赖细胞分裂，既可 转染分裂期细胞，又可转染非分裂期细胞；携带的外源基因不与宿主基因整合， 对人致病性低。这些优点使其成为一种高效而安全的基因转移工具，广泛应用于 基因治疗的研究。我们既往的实验证实IL．24在增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的表达 明显低于正常皮肤及正常瘢痕，提示IL．24的表达降低可能与病理性瘢痕的形成 有密切关系。本实验构建含有人IL．24基因的重组腺病毒载体，为下一步转染病 理性瘢痕成纤维细胞，观察IL一24在细胞中表达后对细胞增长的影响奠定实验基 础。 【方法】 TRIzol法提取皮肤成纤维细胞的总RNA后，利用RT-PCR技术扩增目的片 断IL．24；使用T4连接酶连接BglII及Xho I双酶切后的目的片断IL．24与 pAdTrack-CMV，鉴定并扩增正确重组腺病毒质粒(pAdTrack CMV-IL-24)；挑选 阳性克隆的穿梭质粒pAdtrack．CMV-IL．24转入含有质粒pAdEasy-1的BJ5183感 受态细菌进行同源重组，鉴定、扩增；应用脂质体将成功重组的腺病毒载体质粒 pAdEasy-IL．24转入293A细胞中进行包装、扩增，病毒滴度测定后纯化。应用 纯化后的腺病毒载体感染病理性瘢痕的成纤维细胞。 【结果】1．RT-PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增片断约为620bp，与目 【结果】 1．RT-PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增片断约为620bp，与目 的片断大小基本符合，无非特异性扩增。 2．腺病毒穿梭质粒pAdtrack．CMV-IL．24经B西II及Xho I双酶切后电泳见大 约9kb(质粒骨架)和620bp(IL．24基因)2个片段，与目的片断符合，测序结 果表明克隆得到的序列与GenBank中IL．24序列一致。 3．同源重组腺病毒质粒pAD．IL．24经Pac I酶切后电泳，可见约4．5kb和30kb 左右的电泳带各一条。 4．重组腺病毒质粒pAD．IL．24经质脂体转染293A细胞，2天后开始出现绿色 荧光蛋白(GFP)表达，荧光表达随时间增强。 5．用TCID50方法和GFP阳性计数法计算病毒滴度约为2．0x109pfu／ml。 【结论】 成功构建了有较强感染能力的含hlL．24基因的重组腺病毒载体。 【关键词】 病理性瘢痕；成纤维细胞；hlL．24；腺病毒；基因治疗 2 Construction Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector of hIL．24 ABSTRACT [Objective] Hypertrophic scar and keloid are formed with excessive proliferation of fibroblasts and accumulation of ex