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复旦大学博士论文病毒性肝炎的蛋白质组研究 复旦大学博士论文 病毒性肝炎的蛋白质组研究 摘 要 本博士论文工作的主要贡献为：将亚细胞蛋白质组技术和比较蛋白质组学 方法相结合，研究了丙型肝炎病毒亚基因组复制细胞及其对照细胞的差异蛋白 质组：另外采用1 D SDS—PAGE／LC／MS和2DE／MALDI MS两条技术路线系统地 研究了丙型肝炎病毒亚基因组复制细胞中膜和脂筏蛋白质组；利用基于双向凝 胶电泳和生物质谱方法的策略对HBsAg阳性及具有同样背景但HBsAg阴性的 转基因鼠肝组织进行了差异蛋白质组分析；展示了在MALDI生物质谱基质中 加入添加剂显著改善谱图信噪比的效果，并将此推广应用于高通量的蛋白质组 研究中。 蛋白质组学作为当今生命科学热点与前沿．功能基因组学中的重要研究领 域，近年来得到了蓬勃的发展，已涉足生命科学中一系列热点领域。蛋白质组 研究具有观察由多基因事件引起的多蛋白质组分整体变化的独特优势，更接近 ，土命现象的本质，并在药靶研究中具有潜在价值，目前已被广泛用于研究各种 疾病的发生、发展规律，并取得了很多重大的成就。 病毒性肝炎目前已知包括有甲、乙、丙、丁、戊等五种肝炎病毒类型，其 中乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus HCV)感染呈全球分布，严重影响了人民的身体健康。但是影响病毒性肝炎疾病 发生进程与治疗的因素较多，目前仍有许多问题有待于进一步研究解决。本论 文工作在复旦大学生物医学研究院和复旦大学医学院分子病毒重点实验室已有 工作的基础上，研究了丙型和乙型肝炎病毒感染模型中的蛋白质组变化及其病 理意义。本工作通过对多种体系进行双向凝胶电泳分离质谱鉴定的比较蛋白质 组定量分析，证明了该方法对于中、高丰度蛋白质的比较分析的有效性，它直 观地展示出差异蛋白质的表达图谱，这种差异蛋白表达谱对疾病标记分子的发 现和细胞信号途径等方面的进一步研究提供了实验依据。 本论文由五部分组成。第一章绪论首先概述了蛋白质组学作为一门新兴学 科，它的发展现状和最新的技术进展，包括双向凝胶电泳技术，生物质谱技术， 色谱分离技术，蛋白质芯片技术，酵母双杂交技术和串联亲和纯化技术等。然 后概述了肝蛋白质组研究的进展，提出本课题工作的研究方向。 第二章所述研究工作将亚细胞蛋白质组技术和比较蛋白质组技术相结合， 研究了丙型肝炎病毒(HCV)复制模型的蛋白质组。本工作利用亚细胞蛋白质 组学方法首次研究了转染[tCV亚基因组复制子的人肝癌细胞系Huh7模型 复旦大学博士论文(Huh7一HCV)中蛋白质组的变化，建立了Huh7一HCV的双向凝胶电泳蛋白质表达 复旦大学博士论文 (Huh7一HCV)中蛋白质组的变化，建立了Huh7一HCV的双向凝胶电泳蛋白质表达 图谱和数据库。通过对核、膜和胞浆三类组分进行双向凝胶电泳分离和图像分 析，总共发现289个差异蛋白点。对差异蛋白进行了胶内酶解和MALDI—TOF MS 鉴定，最后得到179个蛋白，其中包括细胞骨架蛋白，与细胞周期，凋亡和信 号转导等相关的蛋白，并且用western blot验证了部分蛋白质组研究的结果。 结果发现，宿主细胞中已知能与HCV非结构蛋白相互的蛋白质如HSP27，alpha actinin，nucleolin和eukaryotic initiation factor 4A．I在Hull7．Hcv中都表现为上 调。本工作不但验证了前人的工作，更进一步揭示了一些受HCV复制调控的新 的宿主细胞蛋白质和信号通路。为进一步研究HCV病毒复制对宿主细胞影响奠 定了丰富的实验数据基础，并初步解释了HCV病毒复制和致病机理。 第三章所述工作采用ID SDS．PAGE／LC／MS和2DE／MALDIMS两种蛋白质 组学方法，系统地研究了Huh7．HCV中膜和脂筏蛋白质组，获得了大量 Huh7一HCV中可能参与HCV病毒复制的蛋白信息。膜蛋白作为生物膜功能的主 要体现者，具有能量转换、信息识别与传递、物质运送等一系列重要的生物功 能，脂筏作为一种特殊的膜结构，在许多生物生理过程中如信号传导和膜通道 的调节和组织中心都起着极其重要的作用，许多有传染性的物质包括病毒、细 菌和寄生虫都是利用这种筏结构而寄居到宿主细胞上。本工作首次建立了有 HCV亚基因复制的人肝癌细胞系Huh7中膜蛋白质组和脂筏蛋白质组数据库， 总共鉴定了462个蛋白，其中主要包括各类结合蛋白，酶，转运蛋白，信号转 导蛋白等等，涉及生理，代射，转运和发育等生理过程。这些数据进一步补充 了人肝蛋白质组数据库。结合第二章比较蛋白质组研究的结果，分析发现其中 有82个差异表达的蛋白为脂筏相关蛋白。对所鉴定的部分蛋白质进行生物学实 验验证，发现hVAP33，Sign