表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组质粒的构建及免疫效应预防兽医学专业论文.docxVIP

摘要猪圆环病毒2型(porcine 摘要 猪圆环病毒2型(porcine cireovirus type 2，PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征及其它 相关疾病的病原。本研究应用基因工程技术构建了表达猪粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子(porcine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、PCV2衣壳蛋自(capsid protein，CP) 及共表达CP和GM．CSF的重组质粒，分析了表达PCV2 CP的重组质粒在小鼠和猪诱导的体液 和细胞免疫反应，以及表达猪GM-CSF和IL．2的重组质粒对PC2 DNA疫苗免疫效果的调节作用。 采用RT-PCR方法从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪GM．CSF的cDNA，构建了真核 重组表达质粒pcDNA3．1．gm—csfi用PCR技术扩增出编码PCV2 CP的ORF2基因，构建了重组 质粒pcDNA3．1一orf2、pcDNA4-orf2，以及共表达PcV2 cP和猪GM．CSF的重组质粒 plRES．orf2／gm-csf。采用间接免疫荧光试验和集落刺激形成试验证明，在COS7细胞中 pcDNA3．1．gm—csf可表达GM-CSF，pcDNA3，1-orf2和pcDNA4-off2可表达PcV2 CP， plRES．ort2／grn—csf能同时表达PCV2 CP和GM．CSF。 用重组质粒pcDNA3．1．orf2和pcDNA4．orf2免疫小鼠，分析了免疫小鼠的体液与细胞免疫应 答水平。结果表明，经3次肌肉注射后pcDNA3．1．orf2免疫组中80％的小鼠血清特异性抗体转阳， peDNA4．off2免疫组中100％的小鼠血清特异性抗体转阳；与对照组相比，pcDNA3．1．orf2免疫组 小鼠脾细胞对丝裂原ConA或重组PCV2 CP的刺激反应显著增强，CTL和NK细胞的杀伤活性 明显提高；pcDNA4-orf2诱导的细胞免疫反应水平低于peDNA3．1．ort2：重组质粒免疫小鼠脾脏 淋巴细胞中CD3+CIM+CD8．细胞亚群和CD3+CD4-CD8+细胞亚群的百分含量提高。此外，发现 肌肉注射和鼻腔接种pcDNA3．1．orf2后诱导的免疫反应没有显著差异。 将7日龄健康仔猪分成5组，分别为空载体(I组)、pcDNA3。1．off2(II组)、 pcDNA3．1-orf2+pcDNA3．1，gm．csf (III组)、 DlRES-orf2／gm—csf ( IV组)、 pcDNA3．1．orf2+peDNA3．I，IL-2(V组)，每组3头，共肌肉注射3次，每次间隔2周。结果表明， 各重组质粒免疫组均产生了低滴度的PCV2特异性ELISA抗体和中和抗体，平均中和抗体滴度分 别为l：6．7，1：29．3，1：26，7，1．20．2；IV和V组免疫猪外周血淋巴细胞的增殖活性高于II组和IⅡ组； ⅡI、I、，、V组免疫猪外周血NK细胞杀伤活性高于II组；重组质粒免疫各组的外周m中Th、Te 和m／aTh含量显著高于空载体对照组，其中V组的Tc含量最高；重组质粒免疫各组的IL-4水平 高于空载体对照组，Ⅳ和V组IL．12表达水平显著高于II和ⅡI组。第3次免疫后4周经口腔和鼻 腔途径接种PCV2 BJ-HB株组织毒。结果表明，各重组质粒免疫组均无体温升高，而且鼻腔和直 肠的排毒率和病毒血症阳性率显著低于空载体组，以V组的排毒率和病毒血症阳性率最低；经免 疫组化和PCR检测结果表明，V组的含毒组织检出率最低。由此表明，混合质粒 pcDNA3．1．orf2+pcDNA3．1一IL．2(V组)的免疫保护效果优于其它重组质粒。重组质粒 pcDNA3．I-IL-2可显著改善重组质粒pcDNA3．1一orf2诱导的免疫反应和保护性反应；GM-CSF基 因能够增强pcDNA3．1-orf2诱导的体液免疫反应。 关键词：PCV2；DNA疫苗；细胞因子；免疫反应：保护效果 AbstractPorcine Abstract Porcine circovirus type 2(PCV2)is the primary pathogen of postweaning multisystemie wasting syndrome(PMWS)and other associated conditions in pigs．In this study,several mammalian recombinant plasmids，expressing porcine granulocyte—macrophage colony—stimulating factor (GM-CSF)，PCV2 capsid protein(cP