杜氏盐藻的rbcs基因及其调控区的克隆和功能鉴定病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

中文摘要杜氏盐藻(Dunaliella 中文摘要 杜氏盐藻(Dunaliella salina)的RbcS基因 及其调控区的克隆和功能鉴定 博士研究生 柴玉荣 导 师 薛乐勋 郑州大学细胞生物研究室 郑州450052 中文摘要 杜氏盐藻(Dunaliella salina，13．salina)属于绿藻门绿藻纲团藻目，是一种 生长在海水或盐湖的嗜盐性浮游单细胞真核绿藻。细胞形态呈梨形或椭圆形，无 细胞壁，胞内有一个大的杯状叶绿体，具有双鞭毛，可以在水中游动。该藻的突 出特点是耐盐能力强，抗逆性极佳，可在0．05M．5M的盐水中生长，是迄今所发 现的最耐盐的生物之一。 杜氏盐藻作为宿主表达外源基因，生产具有药用价值的蛋白质如血管抑素等， 具有繁殖速度快、培养简单、表达产物下游纯化过程简单等优越性。在利用杜氏 盐藻作为生物反应器生产药用蛋白质、口服疫苗等时，为使目的基因得到高效表 达，必须寻找高活性的杜氏盐藻内源性启动子，建立杜氏盐藻的高效表达载体， 使外源基因得到高水平表达，从而获取更多的具有治疗作用的外源蛋白质。 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(Ribulosc 1,5一bisphosphate carboxylase／oxygcnase，E．C．4．1．1．39简称RttBisCO)是光合生物进行光合作用的关 键酶，催化光合作用中的羧化反应和氧合反应，由8个大亚基(RbeL)和8个小豫 基(RbeS)组成。该酶是植物可溶性蛋自中含量最离的蛋白质之一，约占50％。因 此，对于RuBisCO的研究具有重要的理论意义和应用价值。在转基因研究中， RuBisCO的RbeS基因启动子作为高活性的光调控型启动子在高等植物和藻类的 遗传转化中应用较多。 本研究首先以简并引物PCR和RACE(Rapid amplification of cDNA ends． eDNA末端快速扩增)方法从杜氏盐藻中克隆了RuBisC0的小亚基基因(Rbcs) 的全长eDNA序列。根据此eDNA序列信息，设计位于RbeS基因上游的特异引 郑州大学2005博士学位论文 郑州大学2005博士学位论文 物，以基因组步行文库为模板，分离该基因的5’上游的转录调控区．启动子区域。 所得的DNA调控序列与报告基因．除草剂抗性基因bar融合，构建真核表达载体， 用电击法导入到杜氏盐藻中。用除草剂革丁膦(Phosphinothricin．PPT)筛选转化 成功的藻株。通过研究RbcS基因的5’上游调控区的启动子转录调控活性以及在 杜氏盐藻遗传转化中的作用，为建立杜氏盐藻生物反应器提供高效的表达调控元 件。 一、杜氏盐藻RbcS基因的克隆与分析 1实验方法 1．1 RbeS基因部分序列的克隆 根据莱茵衣藻、团藻、玉米等真核生物的1，5一二磷酸核酮糖羧化酶，力Ⅱ氧酶 (RuBisCO)小亚基RbcS基因的氨基酸保守序列设计简并引物。以杜氏盐藻总 RNA为模板，用AMV反转录酶合成eDNA第一链，再以此为模板，PCR扩增 RbcS基因的eDNA片段。RT-PCR产物利用T-A克隆方法，亚克隆到载体pMDl8一T 卜，并测序。测序结果与G-enBank上其他物种的RbcS基因序列进行比对分析， 并用BLAST进行同源性分析。 1．2 RbeS基因全长eDNA序列的克隆及序列分析 提取杜氏盐藻细胞的总RNA，根据上述简并引物扩增出的杜氏盐藻RbcS基 因部分序列信息，利用5’RACE和3’RACE的方法分别向5’上游和3’下游 扩增杜氏盐藻RbeS基因的5’和3’eDNA末端片段。扩增产物亚克隆到载体 pMDl8-T上，转化大肠杆菌JMl09，对经过筛选和鉴定正确的质粒进行序列分析。 根据已经得到的RbcS三段序列信息设计引物，重新利用RT-PCR的方法， 得到杜氏盐藻的RbeS全长eDNA序列。 分别使用Dnaman软件、Primer Primier软件以及GenBank BLAST检索分析 系统等对所扩增的RbeS基因进行氨基酸和核苷酸序列同源性以及密码予偏好性 等的分析。 13杜氏盐藻Rbcs基因的表达分析 杜氏盐藻分别经黑暗12h，光照4h和9h培养处理，提取总RNA，反转录成 eDNA，以此为模板，进行实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCRl，对光／ 暗培养条件下，杜氏盐藻的RbcS的mRNA表达水平进行定量分析；Southern blot 中文摘要 中文摘要 对RbeS基因进行分析。 将杜氏盐藻的RbeS eDNA定向克隆于原核表达载体pET-30a(+)中，构建重 组质粒pET-S，筛选并鉴定该重组质粒。正确的重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21。 经IPTG诱导，使RbcS融合蛋白在大肠杆菌BL21中表达。利用SD