泛素和转铁蛋白受体表达载体的构建表达和鉴定病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

分类号：(R36) 分类号：(R36) 单位代码：10312 密级： 学号南京医针犬掌 硕士学位论文 题 目： 研究生： 李娜 指导教师： 刘宁生 副教授 学科专业： 病理学与病理生理学 学院名称： 南京医科大学基础医学院 完成时间： 二。一五年五月 万方数据 南京医科大学硕士学位论文学一 南京医科大学硕士学位论文 学一明学位论文原创性声明 J煳70㈣18I!Z罄1 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究-rl乍 所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人 作者签名： 碜岬 日期：Ⅻ，多年莎月／：珀 导师签名： 赵古互 日期：。油修年6月j)．-El 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)： 1、保密口，在一年解密后适用本授权书。 2、不保密妙 作者签名：鸡劬妒 日期：弘瞬6月p日 导师签名：昀寺葛 日期：)口／占年莎月J 2同 万方数据 南京医科大学硕士学位论文目 南京医科大学硕士学位论文 目 录 中文摘要 1 Abstract． 。． ．．．． ．。．．．．。．． 。 ．．．． ．． ．．． ． ． ．．．． ．． ． 3 前言 6 第一部分泛素蛋白表达系统的构建、表达和鉴定 ．11 l材料与方法 一l 1 2．结果 2l 3．讨{念： 24 第二部分转铁蛋白受体表达系统的构建、表达和鉴定 ．25 ．1材料与方法 ．．25 2．结果 35 3．讨论 ．4l ，J、 结 ．42 参考文献 43 综j态 一47 缩略词表 ．5959 在读期问发表的论文 ．60 致谢 ．61 万方数据 南京医科大学硕士学位论文泛素和转铁蛋白受体表达载体的构建、表达和鉴定 南京医科大学硕士学位论文 泛素和转铁蛋白受体表达载体的构建、表达和鉴定 中文摘要中又摘要 胞内体蛋白分选是泛素调控内吞作用中的关键步骤，不仅参与养分，代谢 物，激素和生长因子的摄取，分选及处理；维持极性上皮细胞细胞质膜功能域 的分布特点；受体和配体的再循环等多种过程，而且对于维持细胞的许多重要 生理功能(如细胞周期的调控、抗原递呈、信号转导等)有着极其重要的作用。 目前发现的许多遗传性和获得性疾病(如肿瘤、囊性纤维化)的发生都与此途 径功能失调相关。它也参与了机体抑制肿瘤、神经变性性疾病以及感染性疾病 等病理过程，这说明其在细胞内具有非常重要的功能。胞内体蛋白分选转运复 合物(endosomal sorting complex required tbr transport，ESCRT)能将被泛素标 记的蛋白分选入溶酶体途径进行降解。ESCRT也在胞质分裂和病毒出芽过程中 发挥重要作用。 泛素一转铁蛋白受体(Ubiquitin．Transferrin receptor,Ub-TfR)嵌合蛋白由于有 泛素标记转铁蛋白受体，使其在胞内体上被分选进入多泡体／溶酶体的降解途径， 而不是沿着转铁蛋白受体通过再循环内体回到细胞质膜的经典途径，是研究胞 内体蛋白分选途径共同机制的理想标记之一。所以我们通过构建泛素和转铁蛋 白受体表达质粒的构建，为下一步的研究胞内体分选相关蛋白奠定基础。 方法： 1．构建泛素表达载体 采用PCR扩增小鼠泛素基因，经过双酶切，将泛素基因克隆于表达载体 pCI．neo—HA中，测序正确后提取质粒。 2．泛素载体的表达 测序正确的泛素表达质粒转染Hela细胞，裂解细胞，收集细胞裂解液。通 过Western blot检测泛素蛋白的表达。 万方数据 南京医科大学硕士学位论文3．构建转铁蛋白受体表达载体 南京医科大学硕士学位论文 3．构建转铁蛋白受体表达载体 采用PCR扩增人转铁蛋白受体基因，经过双酶切，将转铁蛋白受体基因克 隆于表达载体pCI．neo．HA中，测序正确后提取质粒。 4．转铁蛋白受体载体的表达及鉴定 测序正确的转铁蛋白受体表达重组质粒转染Hela细胞，裂解细胞，收集细 胞裂解液。通过Western blot、免疫荧光等检测转铁蛋白受体的表达。 结果： 1．泛素蛋白载体的构建、表达及鉴定 通过设计特异性引物，经PCR扩增得到泛素基因片段约285bp，与预期相 符；将扩增产物纯化与载体质粒pCl—neo—HA酶切后连接，送公司