保幼激素耐受蛋白在大猿叶虫生殖和滞育中的功能研究农业昆虫与害虫防治专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文2．2．3．2表型分析 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 2．2．3．2表型分析 14 2．2．4 Met的RNAi实验 ．．14 2。2。4．1干扰引物的设计 14 2．2．4．2模板的制备 15 2．2．4．3 dsRNA的合成 16 2．2．4．4 dsRNA的纯化 16 2．2．5 dsRNA的注射 16 2．2．6 I矾Ai后的分子检测 ．．17 2．2．7脂肪体的油红O染色实验 ．．17 2．2．8甘油三酯含量的测定 17 2．3数据分析 ．．1 8 3结果与分析 ．18 3．1 JH对大猿叶虫卵巢发育和脂质积累的影响 ．．1 8 3。1．1 JH对卵巢发育的影响 1 8 3．1．2 JH对脂质积累的影响 18 3．1’3 JH对垤基因转录的影响 21 3．2大猿叶虫Met基因的克隆和序列分析 22 3．2．1大猿叶虫Met基因的全长克隆 22 3．2．2大猿叶虫Met基因的序列分析 24 3．3 Met在大猿叶虫中的时间表达模式 25 3．4 Met基因dsRNA的合成 ．．26 3．5干扰Met对大猿叶虫生殖的影响 ．．27 3．5．1干扰Met对卵巢发育的影响 27 3．5．2干扰Met对坛转录的影响 ．29 3．6干扰Met对大猿叶虫滞育的影响 ．．31 3．6．1干扰Met对脂质累积的影响 31 3．6．2干扰Met对抗逆基因转录的影响 34 4结论与讨论 ．36 4．1结论 36 4．1．1 JH对大猿叶虫卵巢发育和脂质累积的影响 36 4．1．2 Met基因的克隆和与序列分析 ．36 4．1．3 Met在大猿叶虫生殖和滞育中的功能 ．36 4．2讨论 37 4．2．1两种Met基因的功能结构分析 37 4．2．2 JH．Met信号传导途径促进生殖但抑制滞育 37 4．2．3 Met可能并非JH的唯一受体 ．．39 参考文献 ．41 致谢 ．50 II 万方数据 保幼激素耐受蛋白在大猿叶虫生殖和滞育中的功能研宄摘要 保幼激素耐受蛋白在大猿叶虫生殖和滞育中的功能研宄 摘要 保幼激素(Juvenile hormone，JH)可调控昆虫成虫繁殖，缺失JH会导致虫 体生殖滞育，表明JH可能在昆虫生殖发育和成虫滞育中发挥着重要作用。目前 JH在昆虫生殖发育和成虫滞育中的作用机理尚不明确。大猿叶虫Colaphellus bowringi Baly是一种兼性滞育的蔬菜害虫。在25℃下，长光照条件下诱导为注 定滞育个体，短光照条件下诱导为注定非滞育个体，成虫羽化到进入滞育状态 的4天取食期为滞育准备期。注定滞育个体在滞育准备期内卵巢未发育且无卵 黄沉积，脂肪体发育良好，后期填充整个腹部；注定非滞育个体卵巢发育良好， 卵黄发生沉积，脂肪体稀疏。本研究以大猿叶虫为实验对象，采用IⅢAi技术探 究保幼激素耐受蛋白(Methoprene。tolerent，Met)在大猿叶虫生殖和滞育中的功 能。主要结果如下： 1．Jl-I对大猿叶虫卵巢发育和脂质累积的影响 对大猿叶虫注定滞育个体注射15岭保幼激素类似物Methoprene后，虫体 卵巢发育，发育程度与注定非滞育个体相似。相比对照组，Methoprene处理组 坛的表达水平上调，脂肪体内脂滴信号减弱，相对脂质含量降低。 2．Met基因的克隆和与序列分析 通过从大猿叶虫转录组数据库中获得Met的序列信息，根据序列设计引物， 经克隆、测序以及拼接，获得Metl、Met2基因的全长序列，cDNA全长分别为 2045 bp、2044 bp。通过Expasy转录软件进行蛋白的功能结构域分析发现两种 Met仅N端20个氨基酸存在差异，推测两种Met基因功能可能类似。通过Met 的系统发育进化树发现两种Met同属一分支，且与赤拟谷盗Met亲缘性最高。 3．Met在大猿叶虫生殖和滞育中的功能 采用RNAi技术对大猿叶虫注定滞育个体干扰Met后外源施加Methoprene， 垤J和V92的相对表达均显著低于对照组。干扰大猿叶虫注定非滞育个体Met 后，虫体卵巢发育受抑制，类似于滞育虫体的发育状态；脂肪体内脂滴信号减 弱，相对脂质含量上升；相比对照组，脂肪体内Fas、Hsp23、Hsp27的表达水 平显著上调，但Foxo、Hsp21的表达水平与对照组无显著差异。 本研究结果表明，JH通过Met诱导卵巢发育和堙转录促进生殖、抑制虫 体脂肪体的累积和虫体抗逆性，从而抑制滞育的发生。研究结果为JH信号途径 机制的进一步解析提供线索与依据。 关键词：大猿叶虫；保幼激素；Methoprene．tolerant(Met)；基因克隆；RNAi 万方数据 ABSTRACTJuvenile ABSTRACT Juvenile hormon