《SNT1152-2002-鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法》.pdfVIP

SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1152-2002 鲤春病毒血症病毒(SVCV)逆转录- 聚合酶链式反应(RT-PCR) 检 测 方 法 Testmethodofreversetranscriptionpolymerasechain reaction(RT-PCR)forspringviraemiaofcarpvirus(SVCV) 2002-11-25发布 2003-05-01实施 中 华 人 民 共 和 匡 国家质 量监督检验检 疫总辰 SN/T1152-2002 nli 吕 本标准是在总结我国在这一领域的实践经验并参考国际上有关检测规程的基础上制定的。 本标准的附录A是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人:江育林、高隆英、刘羞、史秀杰。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T1152-2002 鲤春病毒血症病毒 S【VCV)逆转录- 聚合酶链式反应(RT-PCR) 检 测 方 法 范围 本标准规定了细胞分离病毒后，用PCR技术诊断Svc病毒的方法。 本标准适用于Svc病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件，其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987) GB/T18088-2000 出人境动物检疫采样 试荆和材料 3.1 水 应符合GB/T6682-1992中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用 DEPC处 理以除掉RNA酶。 3.2 SVC病毒标准株 3.3 Taq酶 一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.4 逆转录酶AMV 10U/mL。一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.5 RNA抑制剂(RNasin) 40U/pL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.6 dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各 10mmoL/L) 3.7 引物 该试验选用Svc病毒的糖蛋白基因作为PCR的模板。该基因长1588by，在这里用了2对引物: F1和R2扩增该基因中的714by片断，而Fl和R4则从该片断中再扩增606by片断。所以实际上是 “半嵌套式”的PCR(semi-nestedPCR)。使用时浓度为40pmol/L。其序列如下: R2:5-AGATGGTATGGA CCCCAATACATH CANCAY-3 R4:5-CTGGGGTTTCCNCCT CAAAGY TGY-3 Fl:5-TCTTGGAGCCAAATAGCTCARRTC-3 SN/T1152-2002 3.8 无水乙醇 分析纯，使用前预冷到一20C. 3.9 矿物油 要求无DNA酶和RNA酶. 4 器材和设备 4.196孔细胞培养板 4.2 倒置显微镜 4.3 恒温培养箱 4.4 普通冰箱和低温冰箱 4.5 组织研磨器 46 离心机和离心管 4.