t细胞免疫功能重建和淋巴管生成对肝癌转移影响的实验研究肿瘤学专业论文.docxVIP

复旦大学博士研究生学位论文论文摘要论文摘要 复旦大学博士研究生学位论文论文摘要 论文摘要 研究目的 建立T淋巴细胞免疫功能重建模型，提供进行免疫与肝癌转移关系研究的 实验平台。应用该模型研究T细胞免疫功能重建对小鼠高、低淋巴结转移潜能 的肝癌的影响，同时研究影响肝癌转移的免疫学因素，为深入寻找肝癌生成、转 移的免疫学机制提供新的思路，寻找免疫干预肝癌转移的方法。 进一步研究经负载不同转移潜能肝癌抗原的树突状细胞(DC)诱导的激活 T细胞免疫功能重建对小鼠高、低淋巴结转移潜能的肝癌的影响，同时进一步研 究影响肝癌转移的免疫学因素，为肝癌生成、转移的免疫学机制。 探讨小鼠淋巴道高、低转移潜能的肝癌细胞在体内淋巴道转移状况和淋巴管 生成对淋巴道转移的影响并分析原因。 研究方法 分离Balb／c小鼠的T淋巴细胞，尾静脉注射入接种高、低转移潜能小鼠肝 癌细胞株的Balb／cnu／nu裸鼠体内，每周重复注射一次，建立免疫功能重建模型。 通过检测实验裸鼠体内的淋巴细胞比例和淋巴细胞功能评定模型的效果。 对T细胞免疫功能重建后的裸鼠足垫接种淋巴道高、低转移潜能细胞株， 观察足垫接种小鼠不同转移潜能肿瘤的生长速度，转移程度。进一步应用DNA 微阵列技术对免疫重建后的裸鼠体内的淋巴细胞进行免疫相关基因的检测。应用 流式细胞仪对不同转移潜能的肿瘤细胞表面的MHC．I、MHC．II进行检测。应用 半定量RT-PCR对肿瘤细胞分泌的免疫抑制相关因子IL一10、TGF d、TGF B的程 度进行进一步检测，寻找影响肝癌转移的免疫学原因。 应用激活的T淋巴细胞进行免疫功能重建。采用Balb／c小鼠的骨髓干细胞 在IL-4与GM-CSF诱导下分化成DC，再负载淋巴道毫、低转移潜能的小鼠肝 癌抗原，诱导Balb／c小鼠T淋巴细胞，对Balb／c nu／nu小鼠进行免疫熏建，观察 足垫接种小鼠不同转移潜能肿瘤的生长速度，转移程度。应用双向混合淋巴细胞 反应体外检测免疫重建的效果。用淋巴细胞增值实验检测肿瘤细胞对淋巴细胞的 免疫抑制作用。采用ELISA法检测免疫重建前后裸鼠体内免疫抑制相关因了 IL．10、TGF以及血管／淋巴管生成相关因因子VEGF的变化。应用Tunel检测方 法对免疫重建组及未重建组的小鼠肿瘤凋亡进行进一步的检测。应用四步离心法 分离高低转移潜能肝癌细胞株的Exosomes，进行电镜检测，并应用 复旦大学博士研究生学位论文论文摘要SELDI-TOF—MS(Serface 复旦大学博士研究生学位论文论文摘要 SELDI-TOF—MS(Serface Enhanced Laser Desorption Inhibition Time Of Flight Ionization Mass Spectrometry,SELDI—TOF—MS)进行进一步蛋白组学分析其中的差 异。应用Exosomes负载的T淋巴细胞进行体外杀伤肿瘤的实验。 将淋巴道高转移潜能(高转移组)、低转移潜能(低转移组)的肝癌细胞通 过足垫接种于Balb／c小鼠，观察成瘤情况，21天后取胭窝、腹股沟、髂总动脉 旁、肾门淋巴结病理染色观察转移情况；并取足垫部位的肿瘤组织，冰冻切片进 行5’一核苷酸酶。碱性磷酸酶双染色，观察淋巴管生成情况。另取高、低转移潜 能的细胞株注射615小鼠形成腹水后，取腹水进行体外淋巴管生成实验，每3 天计数淋巴管生成的数量。提取上述细胞总RNA行小鼠肿瘤转移基因芯片检测， 并对ⅦGF—C、VEGF．D进行半定量R|PCR验证。迸一步用Real time RCR对 高、低转移潜能的肝癌细胞分泌的VEGF．C、VEGF．D进行定量分析。 结 果 免疫重建后裸鼠外周血及脾脏T淋巴细胞的CD3、脾脏T淋巴细胞CD4以 及CD4／CD8值均显著高于对照组(p0．05)。高转移组T淋巴细胞可以明显杀伤 肿瘤细胞(pO．05)。 免疫重建后裸鼠足垫肝癌生氏速度小于免疫未重建组，高转移组的肿瘤生长 速度高于相应的低转移组。免疫重建后淋巴结转移在骼总动脉旁和肾门的转移程 度显著小于免疫未重建组(pO．05)。免疫相关cDNA微阵列技术检测表明在免 疫重建后裸鼠体内存在THl／TH2淋巴细胞改交。进一步的半定量RT-PCR证实 了肿瘤细胞可以分泌免疫抑制因子抑制免疫相关园子。肿瘤细胞表面的MHC．I 表达有显著差异(po．05)，但是MHC--II的表达未见明显的差异。 抗原负载后T淋巴细胞免疫功能重建后裸鼠足垫肝癌生长速度小于对照组 (p0．05)，高转移组的肿瘤生长速度高于相应的低转移组。免疫重建后淋巴结 转移在髂总动脉旁和肾们的转移程度显著小于免疫未重建组(p0．05)。高、低 转移潜能的肝癌细胞上清液未对淋巴细胞增值有一定的促进作用(pO．05)。