《SNT1139-2002-蚕豆染色病毒血清学检测方法》.pdfVIP

蚕豆染色病毒血清学检测方法 Serological detection method of broad bean stain comovirus SN ／T 1139— 2002 前 言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：陶庭典、许志刚、易建平、印丽萍、杨翠云。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了蚕豆染色病毒的DAS-ELISA检测方法。 本标准适用于蚕豆种子、种苗及其他相关作物中蚕豆染色病毒的检测。检测蚕豆及其他作物种子内的病毒时，其种子须经发芽或种植并形成小苗 后再进行检测。 2 缩略语 以下缩略语适用于本标准。 DAS-ELISA双抗体夹心酶联免疫吸附分析法 PBS磷酸缓冲液 10× PBS 10倍浓度的PBS母液，用来快速配制PBS缓冲液 PBST含吐温一20的PBS SEB样品抽提液 IgG指纯化的蚕豆染色病毒抗体IgG Coating— IgG指用于包被酶联板的蚕豆染色病毒的抗体IgG IgG-conjugate指用碱性磷酸酶标记过的蚕豆染色病毒的抗体IgG CB包被缓冲液 3 方法提要及其依据 蚕豆染色病毒是Lloyd等于1965年在英国的蚕豆上发现的。它是一种直径约28 nm的球状病毒。主要分布在非洲和欧亚地区。蚕豆染色病毒属于豇 豆花叶病毒科( Comoviridae )、豇豆花叶病毒属 ( Comovirus )。蚕豆染色病毒具有中等强度的免疫源性，产生的抗体可以用作各种血清学反应。 感病叶片汁液中含有较多的病毒粒体，可以通过血清学反应进行检测。血清学方法中的DAS— ELISA是一种稳定性好、特异性强的方法，本标准采用被 国内外广泛使用的DAS-ELISA方法检测蚕豆染色病毒。 4 仪器设备 4.1 酶联板。 μ μ μ μ μ 4.2 可调式移液器(2.5 L：10 L、100 L、200 L、1 000 L各一支)及相应吸头。 μ 4.3 12孔道200 L可调式移液器及吸头。 4.4 酸度计。 4.5 调温水浴锅或调温培养箱。 4.6 ELISA洗板机(不是本标准所要求的)。 。 4.7 酶标仪。 4.8 微量样品榨汁机(无微量样品榨汁机时，用研钵进行手工研磨制样)。 4.9 量筒(10 mL、20 mL、50 mL、100 mL、500 mL、1 000 mL各一个)。 4.10 分析天平：精度1 ／10 000 g。 4.11 试剂瓶(10 mL、50 mL、100 mL、500 mL、1 000 mL各两个)。 4.12 封口膜。 4.13 吸水纸。 5 试剂、溶液及生物制 剂 本标准中所有化学试剂的纯度除特别说明外均为分析纯。 5.1 10× PBS的配制 a) 81.8 g氧化钠； b) 1.49 g氯化钾； c) 2.72 g磷酸二氢钾； d) 14.2 g磷酸氢二钠(Na HP0 .2H 0)； 2 4 2 e) 加水定容至1 L。 5.2 PBS的配制 a) 100 mL 10× PBS； b) 850 mL水； c) 调节pH至7.4后再用水定容至l L。 5.3 PBST的配制 在PBS中加入Tween一20，使Tween一20的浓度为0.1％。 5.4 SEB的配制 在PBS中加入以下试剂配制SEB a) 聚乙烯吡咯烷酮(使其终浓度为2％)； b) 卵白蛋白(使其终浓度为0.2％)； c) Tween一20(使其终浓度为0.05％)； d) NaN (使其终浓度为0.05％)。 3 5.5 CB的配制 a) 1.59 g碳酸钠； b) 2.94 g碳酸氢钠， c) 0.