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蛋白质大分子的堕童鉴定与分析新方法的研究摘 蛋白质大分子的堕童鉴定与分析新方法的研究 摘 要 ／随着基因工程和蛋白质工程的发展，生物学家获得了更多的蛋白质信息。 如何快速、灵敏地鉴定微量的基因产物和蛋白质产物成为生物学家关注的一个 问题。近些年来，随着电喷雾质谱和基质辅助激光解析质谱的发展，生物质谱 仪不仅可以提供样品的精确分子量，而且借助于碰撞诱导解析已逐渐成为鉴定 和分析蛋白质的重要工具。经典的测定方法，如SDS—PAGE、采用UV作为检 测器的HPLC、CE等方法，并不能提供分子量和结构信息。而质谱作为一个通 用性检测器可以很好的与HPLC、CE联用，并提供分子量和结构信息，可以对 蛋白质等生物大分子进行直接的鉴定分析。研究表明，LC．ESIMS及CE—ESIMS 具有很高灵敏度及准确性，己逐渐成为蛋白质鉴定分析的一个核心检测分析工 具。 蛋白质和基因工程使得大规模提取和生产有用蛋白质成为可能，如何建立 快速、灵敏的鉴定蛋白质产物的方法是迫切需要解决的问题。生物质谱通过测 定蛋白质大分子分子量、肽谱和氨基酸序列等信息可以直接对蛋白质产物进行 鉴定分析。虽然国际上己有不少报道，但是，鉴于基因工程产物和蛋白质提取 物比较复杂，针对性很强，样品的前处理，予分离，分析条件的优化，海量数 据的处理，数据库检索等问题， 仍需要有相当完善的方法学研究。另外，由于 生物质谱的谱图没有成熟的规律性，如何解析CID谱图成为质谱应用于生物大 分子鉴定、分析的一个关键问题。由于中国人类基因组学和蛋白质组学的实施 和竞争，新蛋白产物和未知蛋白的质谱鉴定已成为举足轻重的技术之一。因此 对生物质谱的蛋白质鉴定分析方法的研究具有重要的意义。／∥ 本论文对生物质谱在蛋白质分析的方法学的基础问题和生命领域中的应用 问题进行了研究和探讨，并得到了一些有意义的结果。趺千尤?p疗面概括了本‘、 论宾鸽主要研究内容和贡献：’ 1．样品的前处理：蛋白质样品的前处理指的是如何去除盐类、表面活性剂等 小分子试剂的干扰。除了采用经典的分离方法如HPLC、凝胶层析等方法，本 论文探讨了一些微量样品的微处理技术及方法如；ziptip除盐方法，微柱毛细 管分离技术，有机溶剂沉淀方法，微过滤分离等，对这些方法的使用条件进行 了研究，《表明ziptip除盐方法，有机溶剂沉淀方法和微过滤分离方法仅仅适合 于蛋白质浓度较高的样品，而微柱毛细管分离技术则可以对微量样品进行分离 处理，该技术的研究及方法的建立对生物质谱的测定具有重要的意义。／r。 2．标准方法的研究：由于生物质谱技术刚刚发展起来，因此对其标准方法的 2．标准方法的研究：由于生物质谱技术刚刚发展起来，因此对其标准方法的 研究及建立具有重要的意义。体论文采用溶菌酶作为标准样品， 建立了蛋白质 的质谱鉴定及分析的标准方法。从生物样品分子量的测定，肽谱分析，蛋白质 的鉴定三方面对生物质谱在蛋白质分析及鉴定中的应用进行了研究。本论文对 蛋白质样品的分子量测定的影响因素如pH，溶剂，仪器参数，进样速度等参数 进行了研究与讨论，揭示pH值的改变对蛋白质样品的测定具有重要影响。同 时，通过ESIMS的溶菌酶分子量的测定(14，303．2Da)，肽谱的建立，及部分 氨基酸序列的分析(IVsDGNGMNAwVAwR)，和数据库各种搜索方法的应用，成功 的鉴定了该蛋白质。基于标准方法的建立，对一系列标准蛋白质 (Chymotrypsinogen A，Aldolase，Katalase，Ferritin等)进行了测定，并研究 了不同的pH、溶剂及OR条件对样品测定的影响。并对肽谱分析中的各个因素 如酶解的条件，质谱参数的设置等进行了研究。该方法的建立为生物质谱鉴定 蛋白质提供了重要的技术及方法。，f。 3．基因工程新产物的鉴定：本论文基于标准方法的建立，对～些新的基因产 物(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM．CSF)，PKI，78， 降钙素基因相关肽 等)进行了鉴定分析。钵实验采用HPLC与ESIMS对基因产物进行分析及鉴定。 对GM—CSF、降钙素基因相关肽和PKl的蛋白质鉴定是国内外首次报道。结果 表明所测定的分子量(CSF及PKl分别为14，472Da，8，468．8Da)与理论预 计值(14，599Da，8，468．3Da)基本～致，并对谱图中其它蛋白质分子量的 信息给以了详细的解释。同时，根据CID谱图推断出的氨基酸序列与cDNA推 断出的序列一致。从质谱得到的信息可以准确的鉴定该蛋白质与理论预测的一 致。本文也对基因产物的鉴定中存在的问题进行了探讨，表明生物质谱是基因 产物的鉴定分析的一个新型检测工具。一，’ 4． 未知蛋白质提取物的鉴定分析：本论文采用HPLC及ESIMS对未知蛋白质 (碱性脂肪酶及鲨鱼软骨血管抑制因子)进行了鉴定