冻存对自发性高血压大鼠配子和着床前胚胎的影响人体解剖与组织胚胎学专业论文.docxVIP

圭塑塑三匡型查兰壁主堂堡鲨茎——中文摘要 圭塑塑三匡型查兰壁主堂堡鲨茎—— 中文摘要 随着越来越多基因被测序和克隆，各种新型基因敲除和转基因动物模型的数目不断增 加，它们的保存要求也越来越高，以备后基因组时代的研究。如果以常规的繁殖方式来维 持这些种系，不仅要消耗大量的经费，占据大量的空间，而且在长期的养殖过程中，不可 避免地会发生自然灾害，诸如火灾，疾病，生育失败，以及遗传污染和种系退化——变异 和遗传污染等问题。配子和胚胎的冻存无疑是一个非常有前途的保存动物模型的方法，刘 于人类不孕治疗、珍稀和濒危动物的保护以及家畜的运输和繁殖同样具有重要的意义。 配子的冻存还可以克服胚胎冻存时面临的法律和伦理问题。尽管人类、小鼠和一些家 畜(如牛、羊)的胚胎和精子的冻存已获得成功，但是大鼠胚胎和配子冻存的相关资料j}： 常少。有限的大鼠胚胎的冻存研究都集中在冻存方法以及冻存后的结果(如存活率)上， 对大鼠胚胎在冻存过程中的内在变化并未予以关注。至于大鼠的精子和卵母细胞的冻存至 今未有成功的报道。 自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)作为公认的研究人类高血压病 的动物模型，对其保种技术的要求也越来越高。胚胎和配子的冻存是一种极有前途的保种 技术。冻存是的过程十分复杂，涉及到冷冻、复苏、和冻存剂等方面，本研究中，经过火 量的预初实验，我们确定了冻存和复苏方法，在此前提下，不再以冻存方法和冻存存活率 为研究重点，而是把SHR大鼠胚胎和配子作为一个整体，研究冷冻对它们的内在影响。 —J第一部分冻存对SHR大鼠精子活力的影响l 心 目的：尽管人类精子的冻存技术已基本成熟，小鼠精子也在九十年代末冻存成功，但 是迄今为止仍没有大鼠精子冻存成功的报道。我们的研究在确定了冻存方法的条件下，旨 在选择适合SHR大鼠精子的冻存保护剂，探讨冷冻对大鼠精子细胞膜完整性，DNA结构、 顶体反应和线粒体功能(ATP合成)的影响，为今后有针对性的改进大鼠精子的冻存方法， 改善大鼠精子的冻存保护剂提供实验和机理上的依据。 方法：l利用在人类精子低渗反应，比较大鼠精子，小鼠精子和人类精子的渗透特性。 2利用计算机辅助精子分析技术定量分析冻存后大鼠精子的活动力、前向运动和路径速度． 以及台盼蓝检活方法，比较8种不同的冻存保护剂，确定适合SHR大鼠精子的冻存保护剂。 3冻存保护剂选定后，观察冻存对大鼠精子的影响。(1)运用台盼蓝拒染法和FDA荧光染 色法检测大鼠精子细胞膜的完整性：(2)运用吖啶橙(AO)荧光检测精子细胞核的结构： (3)应用金霉素(CTC)荧光检测、精子穿卵试验和顶体酶B-D-半乳糖苷酶活力测定等 上海第二医科大学博士学位论文方法检测冻存对大鼠精子项体的影响；(4)利用双氢鲁丹明荧光反应对线粒体功能进行定 上海第二医科大学博士学位论文 方法检测冻存对大鼠精子项体的影响；(4)利用双氢鲁丹明荧光反应对线粒体功能进行定 性观察。以上四项实验都以激光扫描共聚焦显微镜为观察工具。4．采用氧电极测定法研究 冻存对大鼠精于线粒体呼吸链复合体I、复台体II和复合体IV呼吸控制比(respiraI(盯control ratio．RcR)的影响。 结果：1．大鼠精子在人类精子低渗检测液中根本无低渗反应，小鼠精子和人类精子的 低渗反应相似；2．20只SHR的附睾尾部精子的冻存实验结果显示，大鼠精子在人类精子 冻存保护剂中平衡不足5分钟(尚未冻存)，全部失去活动能力。所有配方中，以含3％和5％ 甘油的Penfold LM配方的保护效果最好，但是两种配方的冻存保护剂中的精子复苏后，它 们的活动力和前向运动均有下降，精子活动力分别是冻存前的52％和39％，两者无显著差 异；但台盼蓝检活检活结果显示含5％甘油的Penfold LM配方的精子膜完整性更好；3选 择含5％甘油的Penfold LM配方冻存SHR精子。(1)FDA荧光检测和台盼蓝拒染均显示 冻存后的大鼠精子细胞膜完整，没有受到破坏。(2)AO染色显示冻存对大鼠精子细胞核 没有破坏作用。(3)CTC荧光反应显示冻存后精子顶体反应的类型发生改变，AR型(发 生了顶体反应)精子比例明显下降，由冻存前的68．6％下降为冻存后的13 4％，但是获能 精子的比例未发生明显变化(92 6％对90．8％)；精子穿卵试验的结果发现冻存组精子的受 精指数下降(23．4±7．021 VS 10 2±3．95)：冻存后精子顶体酶——B-D．半乳糖苷酶活力 明显下降(9 39-----1．98 VS 4．50±i．40)；(4)冻存后，精子线粒体荧光强度下降，线粒体 鞘处荧光出现分节，甚至出现荧光消失的现象；冻存对位于精子线粒体膜上的呼吸链复合 体I、II的呼吸控制比影响不大，但是对复合体Ⅳ的呼吸控制比