泛素蛋白酶体系统中蛋白质的相互作用病理与病理生理学专业论文.docxVIP

中国医学科学院＆中国协和医科大学硕士论文 中国医学科学院＆中国协和医科大学硕士论文 3 泛素／蛋白酶体系统中蛋白质的相互作用 研究生：郭佳岩 导师：高友鹤 中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院 中文摘要 泛素一蛋白酶体系统(Ubiquitin—proteasome system)作为生物体最主要的蛋白 质降解系统之一，越来越多的引起人们的关注。该系统普遍存在于原核生物和真核生 物细胞中，其主要功能是降解机体正常情况下和应激状态下产生的异常蛋白质以及绝 大多数细胞核和细胞浆内短寿命蛋白质，后者包括一些重要的调节蛋白如转录因子、 细胞周期调节因子和信号转导因子等。该系统还可以降解细胞质中的大分子蛋白，使 之成为肽片段。与溶酶体蛋tt溶解系统(Lysosome system)不同的是泛素一蛋白酶体系 统是一个受到精细调节的蛋白质降解系统，可特异性的识别被降解的蛋白质。这种识 别的特异性主要与该系统中的泛素一结合系统有关。 泛素一结合系统(Ubiquitin—conjugation system)是泛索一蛋白酶体系统中的酶系 统，主要由泛素一激活酶(Ubiquitin—Activating Enzymes，E1)、泛素．结合酶 (Ubiquitin—ConjugatingEnzymes，E2)、泛素．蛋白连接酶(Ubiquitin．ProteinLigase，E3) 组成。其中泛素一蛋白连接酶的作用尤为重要，即特异识别靶蛋白，并将其传递给蛋 白酶体降解，如人们研究较详细的E3是E6．AP，它被发现与人乳头瘤病毒的E6原 癌蛋白诱导的P53的泛素化密切相关。尽管人们普遍认为E3s在蛋白质识别方面发挥 至关重要的作用，但对其功能仍然所知甚少。许多不同的泛素化酶被认为泛素化不同 的蛋白质底物，因此了解这个系统的蛋白质组成及蛋白质底物如何被该系统特异性的 降解是当前面临的主要问题。我们通过研究泛素化过程中蛋白质的相互作用来深入探 讨这个问题。 本实验选择泛素一蛋白连接酶中最具特色的成员一--WWPl作为研究对象，希 中国医学科学院＆中国协和医科大学硕士论文 中国医学科学院＆中国协和医科大学硕士论文 4 望通过发现与WWPl相互作用的蛋白质，了解与其一起发挥作用的其它蛋白质以及 通过其降解的蛋白质具有哪些特点及共性。WWPl是HECT结构域家族中比较新的 成员之一，其特异性的生物学功能目前并不清楚。W、vPl含有三种结构域：一个C2 结构域、4个ww结构域及一个HECT结构域。我们主要利用酵母双杂交技术筛选 与人WWPl相互作用的蛋白质。在本实验中，筛选的结果是在人心肌的cDNA文库中未 找到与之相互作用的蛋白质i而在小鼠3T3细胞的c1)NA文库中共筛选到5个阳性克 隆，分别标记为WK一3、WK-4、WK一8、WK-9和wK一10。PCR检测它们插入片段的长度分 别为：1500—1700bp(WK一3)、2500b左右(WK-4)、2000bp左右(WK-8)、1300bp左右 (wK一9)、1500—2000bp(WK一10)。5’端测序结果显示：wK一3由于存在二聚体无法得到 测序结果；wK一8为一个已知蛋白——Ww结构域结合蛋白2(WWdomainbindingprotein 2，Wbp2)的全长编码序列：WK-4、WK-9和WK-10根据载体读码框架翻译的氨基酸 序列在GenBank数据库中tBlastn的结果均无任何蛋白质片段与之相似。通过其他生 物信息学的检索方法如Motif Scan、SMART等方法从现有的蛋白质数据库中检索这 三个片段的结构特点，也找不到任何相关的信息。 根据上述分析的结果以及wwPl的结构域特点，我们将研究的重心放在确定WWPl 中哪一个结构域与筛选的阳性克隆有相互作用的关系。我们将c2结构域和4个ww 结构域构建在同一个载体中；将HECT结构域单独构建一个载体。利用酵母双杂交技 术鉴定与文库中筛出的蛋白或基因片段相互作用的结构域。研究的结果表明：四个文 库质粒的插入片段均与C2-WW结构域结合，而与HECT结构域无相互作用。其中wK一8 即ww结构域结合蛋白2具有ww结构域结合序列的典型特征，可以肯定认为结合ww 结构域；wK一4具有脯氨酸富集序列，认为很有可能与ww结构域相互作用；而WK-9 和wK一10的插入片段无上述特点，可能与c2结构域相互作用，但也不排除与ww结构 域结合的可能，如果确与1vw结构域结合，将打破ww结构域结合配体的传统模式，但 这需要进一步的实验将之区分开来。 关键词：泛素一蛋白酶体蛋白质相互作用酵母双杂交WWPl C2结构域 ww 结构域HECT结构域 中国医学科学院＆中国协和医科大学硕士论文Protein 中国医学科学院＆中国协和医科大学硕士论文