表皮生长因子受体介导的靶向性基因治疗导入系统病原生物学专业论文.docxVIP

表皮生长园子受体介导的靶向性基因治疗导入系统表皮生长因子受体介导的靶向性基因治 表皮生长园子受体介导的靶向性基因治疗导入系统 表皮生长因子受体介导的靶向性基因治 疗导入系统 中文摘要 肿瘤基因治疗有望成为除手术、放疗和化疗等方法外的又一新的抗癌策略。 尤其在抗肿瘤转移和复发方面将起重要作用。目前还缺乏将基因导入肿瘤细胞的 高效靶向性载体系统，这是肿瘤基因治疗至今尚未成为临床常规治疗措施的关键 因素之一。表皮生长因子受体(EGFR)由于在很多肿瘤有高表达，因此是一个很 好的靶点。本研究旨在建立一种靶向EGFR受体的基因导入系统并检验其有效性， 为肿瘤的靶向性基因治疗提供可靠的理论依据与实践指导。 第一部分 利用噬菌体多肽展示文库筛选表皮生长因子受体的配体多肽 【目的】寻求可以与表皮生长因子受体(EGFR)受体特异性结合的配体多肽。【方 法】以EGFR蛋白为靶，利用噬菌体展示随机12肽库进行筛选：或者构建稳定高表 达EGFR突变体III(EGFRvIII)胞外区的U87细胞系，以该细胞系为筛选靶，利用 环7肽库和12肽库进行筛选。经过多轮筛选后，随机挑选克隆进行测序。把富集 的克隆通过免疫组化及噬菌体回收试验鉴定获得可以与靶蛋白结合的克隆；进一 步采用内吞实验研究噬菌体阳性克隆的特征。【结果】通过EGFR蛋白为靶筛选， 经过三轮筛选获得展示GEl 1(YHWYGYTPQNVI)多肽的噬菌体Phage—GEl 1。噬菌体 回收实验中，Phage—GEll可以和EGFR有效结合，而且可以被EGF和GEll多肽所竞 争抑制。免疫组化结果显示Phage～GEll可以和EGFR表达阳性的细胞 SMMC一7721，NCI-H460结合，但和EGFR表达阴性的细胞K一562细胞没有结合。此外， 免疫荧光结果显示Phage—GEllN以被SMMC一7721细胞所内吞。但是，以高表达EGFR 突变体III的细胞系作为筛选靶进行筛选并没有获得阳性克隆。【结论】噬菌体文 库展示技术是一项获得配体多肽的有效技术，特别是以纯化蛋白作为筛选靶可以 更有效地获得阳性克隆。Phage—GEll可以与EGFR特异结合，并被EGFR表达阳性的 细胞所内吞。 复旦土学 上海市肿瘤研究所 博士语文_llI 袭皮生长阁子受体舟导的靶向性基闲治疗导入系统【关键词】EGFR，噬菌体展示，配体多肽，内吞，噬菌体回收实验。 袭皮生长阁子受体舟导的靶向性基闲治疗导入系统 【关键词】EGFR，噬菌体展示，配体多肽，内吞，噬菌体回收实验。 第二部分 GEll多获酌生物学特征 【茸静】分析GEll多肤的生物学特征。【方法】4I标记GEll，然焉分剐与 s～强fc一772l细胞及EGFR蛋盎进行竞争结合试验，采用饱和结合的方法计算解离豢 数；采用尾静脉注射研究碘标多肽在荷瘸小鼠体内的分布。采用FITC标记技术梭 {；l||GEll是否霹戳被缀照内孬，遽过MTT实验捡溪qGEll熬侄有簇分裂活性。【结巢】 ”5I—GEll可以与SMMC一7721和EGFR蛋白有效结合；过燮未标记的EOF或GEll多肽都 可缓竞争掷销“I—GEll豹结合；两基遭鬃的GElt遣可黻反遗米捧翻“I—EGF与EGFR 的结合。”5I-GEtl与EGFR继合的解离常数为22．28±0，4 nM：”5I—GEll可以宣集到 荷SMMC-7721肝癌裸鼠的肿瘤组织，尤其是在淀射后4小时，肿瘤缎织内的放射活 性最离{如鄹时注射过量游离的GEll多肽，则可以攒制 I—GEll强黪瘤缀织中躲 富集；荧光标记的GEll可以被SMMC一7721细胞所内吞，这中内吞可以被EGF或GEll 多熬涨竞争攘到，褥不会被无关多默翳李露翱。1瑟g／ml弱EOF对S1瓣C-7721缨藏豹 促有熊分裂作用约为50％，而1 u g／m1的GEll多肽则只有约10％，而且增加溶度 对这晕}l{乍霜并没有明显豹影响。【结论】GEll蔻EGFR新的配律多获，有望阁于EGFR 受体介导的靶向性肿瘤治疗。 ．， 【关键词】碘标记，竞争结合实验，亲和常数，体内分布，阿吞，促有丝分裂活 经。 第三部分 以聚乙烯亚胺为Dm包装元件，GEll为靶向元件的基因导入系统的 构建、寝征及律海磐靶向基因导入试验 【目的】以GEll作为靶向元件，以聚己烯亚胺(P01yethylenimine，PEI)作为 包装DNA豹嚣桨，构建GEll基瓣导A系统并检测萁在镕肉岁}靶离藿函警入豹缝 力。【方法】用双功能交联剂分别将配体多肽GEll(含有接头序列(GGGGS)。)与 线性PEI(22Kd)形成共价复合物gPEI，然后包裹编码荧光素酶(1uci ferase) 报告基因的质粒pGL3。采用凝胶阻滞实验和DNA酶壤护试验及粒经测定分板DNA 差熏点学 上舞事瓣燕．1i}宪辑 博寿语