talen技术构建斑马鱼先天性心脏病gata4基因敲除模型的研究动物学专业论文.docxVIP

学校代码： 学校代码： 10023 学 号：$2012020001 硕士学位论文 TALEN技术构建斑马鱼先天性心脏病ga ta4基因敲除 模型的研究 所 院 国家卫生计生委科学技术研究所 姓 名 刘静 指导教师： 孙德明研究员 导师小组： 孙德明何嘉玲 学科专业： 动物学 研究方向： 疾病动物模型 完成日期： 2015年4月27日 万方数据 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文目 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文 目 录 摘要 ． ．I Abstract．．．．．．．．．．．．．．．． Ⅱ 前言 ． 1 1、斑马鱼概述 2、斑马鱼胚胎心脏发育概述 1 3、先天性心脏病与gata4基因概述 2 4、TALEN技术 3 4．1 TALEN技术简介 3 4．2 TALEN技术的原理 3 4．3 TAI．EN的构建方法 4 4．4 TALEN技术应用 5 5、CⅪSPR／CAS9技术 5 6、本文的研究意义 ．． 5 材料和方法 6 实验材料 6 l、实验动物 ．． 6 2、菌种、质粒 6 3、工具酶 4、试剂盒 6 5、其他试剂 6 6、主要仪器及耗材 7、主要试剂配制 实验方法 ．． 1、基本方法 万方数据 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文1．1斑马鱼gata4基因的提取 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文 1．1斑马鱼gata4基因的提取 oc! 1．2引物设计与合成 ．． 矗 1．3 PCR扩增目的片段 9 1．4电泳检测PCR产物 ． p 1 5普通PCR产物纯化 ． m 1．6质粒的提取 ．． ∞ 1．7质粒的双酶切鉴定 ．． n 1．8普通琼脂糖凝胶DNA回收 U 1．9连接 ．． 他 1．10氯化钙法制备感受态细胞 ． 他 1．11转化 ． ¨ 1．12阳性克隆的筛选与鉴定． B 1。13体外转录 ． ．13 1．14斑马鱼饲养及繁殖 ． ．．．，．．，．．14 1．14．1斑马鱼的饲养环境 ．14 1．14．2斑马鱼饲料 ．14 1．14．3斑马鱼的雌雄鉴别 ．15 1．14．4受精产卵 ．15 1．14．5胚胎孵化 ．15 1．14．6幼鱼的培育 ．15 1．15显微注射 ． 15 1．16测序 ． 16 2、TALEN实验流程 ．16 2．1敲除靶点的选择与确认 ． 16 2．2采用“单元组装法”构建pMD-TALE载体 17 万方数据 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文2．3构建TALEN表达终载体 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文 2．3构建TALEN表达终载体 17 2．4 TALENs质粒体外转录 18 2，5 TALEN体内活性检测 18 2．6斑马鱼gata4敲除动物模型检测 18 结果与分析 19 l、斑马鱼gata4基因的靶点分析结果 ．，19 2、gala4基因扩增与敲除靶点比对 ．19 3、“单元组装法”构建pMD-TALE载体 ．．20 3．1左半位点(pMD-TALE-L)、右半位点(pMD—Tm正一R)构建方案 20 3．2左半位点(pMD-TALE-L)、右半位点(pMD-TALE-R)构建过程 2l 4、pCS2-PEAS—L和pCS2一PERR-R终载体的构建与鉴定 ．24 5、TALEN体内活性检测 25 6、斑马鱼gala4敲除动物模型检测 ．．27 6．1酶切法检测TALEN敲除效率 27 6．2 Fo代基因型检测 ．28 6．3斑马鱼胚胎心脏结构观察及心率的测量 28 讨{念 一 结论 ． 33 参考文献 34 附录1：综述 ． 附录2：中英文缩略词表 ， 47 附录3：所用载体信息 ． 49 附录4：测序结果 ， 附录5： 个人简介 5l 致谢 52 万方数据 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文独创性声明 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文 独创性声明 ．． 53 学位论文版权使用授权书 53 万方数据 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文摘要 中国医学科学院＆北京协和医学院硕士学位论文 摘要 目的 先天性心脏病(CHD)是人类一种非常普遍和具有破坏性的出生缺陷性疾 病，其发生与gata4基因突变有关。gata4参与调控心肌细胞中某些特定基因的表达， 对心肌细胞的形成、心脏前体细胞的迁移和分化、心瓣膜及间隔发育等具有 重要作用。基因敲除技术构建gata4基因敲除的动物模型有助于人类先天性 心脏病致病机制和治疗的进一步研究。类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN) 介导的靶向修饰技术是目前广泛使用的成熟的基因敲除技术，它主要含有两个重要 的结构域：特异性识别核酸的靶点识别域和切断DNA序列的核酸酶功能结构域。 人工构建针对gata4基因第一外显子的重组核酸酶TALEN，在体内对特定位点产