肝癌组织cdna文库的构建及肝癌肿瘤抗原基因的筛选外科学专业论文.docxVIP

硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 摘要 目的：应用肝癌患者血清，从人肝癌组织构建的cDNA表达文库 中克隆新的肝癌抗原基因，为寻找和鉴定新的肿瘤抗原探索一条新途 径。 方法：从人肝癌组织中抽提总RNA后磁珠法分离nLRNA，以纯化 的mRNA为模板，以含sfi I酶切位点的oligo(dT)引物合成cDNA 的第一链，利用SMART(Switching Mechanism At 5 end of RNA Transcript)技术，经LD—PCR合成双链cDNA，该产物经蛋白酶K消 化，sfi I酶切后经Chroma spin一400柱分级分离，插入片段与入 TripIEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库。测定原始文库的 滴度，进行蓝白筛选以确定文库重组率，并随机挑选克隆经PCR扩增 鉴定插入片段的大小。最后将文库进行扩增并鉴定库容量。用人肝癌 患者血清对肝癌组织cDNA文库进行免疫学筛选，阳性克隆经PCR检 测鉴定后进行序列分析。 结果：测定原始文库滴度为6．9x 106pfu／ml，重组率为97。6％。 原始文库扩增后，测定文库滴度为1．7×109pfu／ml，随机挑取45个 克隆经PCR法鉴定插入片段的大小，插入片段介于0．5—2．Okb之间， 平均长度为1．3kb。文库经三轮筛选后共获得7个阳性克隆，经PCR 扩增后进行测序分析及相关数据库比对，分别代表了7个cDNA插入 片段(抗原基因)。其中5个与已知基因高度同源，另外2个基因与 硕士学位论文 硕士学位论文 中文摘要 GenBank中已知基因部分同源，其中有2个可能是新基因。 结论：本实验成功构建了人肝癌组织的eDNA文库，文库质量较 高，有利于以eDNA文库为基础的进一步的实验研究。用肝癌患者血 清筛选文库，共得到7个肝癌相关抗原基因，其中有2个可能是新基 因，它们与肝癌的相关性有待于进一步的研究证实。 关键词：肝癌：eDNA文库：肿瘤抗原：基因克隆 II 硕士学位论文 硕士学位论文 英文摘要 ABSTRACT Objective：To construct a eDNA library from human hepatocellular carcinoma tissue． Methods：The total RNA WaS extracted from human HCC (hepatocellular carcinoma tissue)and the rnRNA was isolated from the total RNA by MagneSphere technique，and then the first-stand eDNA was synthesized with oligo(dT)primer containing sfi I site while the double—strand cDNA was amplified through LD—PCR(10ng—distance PCR) by SMART technique。The double strand cDNA was digested by sfi I (I AI B)restriction enzyme before cDNA size fractionation， and the double—strand cDNA fractionated was ligated into the入TriplEX2 vector and then Was packaged into入phage in vitro．Titering the unamplified library，and determining the percentage of recombinant clones．Then， screening eDNA insert by PCR to tes