草莓病毒分子检测及其部分基因组序列分析果树学专业论文.docxVIP

缩略词* 缩略词 *一英文缩写英文全名———— 一一一 —————————————— 一 中文译名一—“————————一～ ～～ SMoV Strawberrymottle virus 草莓斑驳病毒 草莓轻型黄边病毒 virus SMYEV Strawberry mildyellow edge SCrV Strawberry crinkle virus 草莓皱缩病毒 SVBV Strawberry vein banding virus 草莓镶脉病毒 PCR Poiymerase chain reaction 多聚酶链式反应 RT二PCR Reverse transcription PCR 反转录PCR NASBA Nucleic acid sequence based 依赖核酸序列的扩增 amplification dsRNA Double．stranded RNA 双链RNA RNasin Ribonuclease inhibitor 核糖核酸酶抑制剂 ELISA Enzyme—linked immtmosorbent assay 酶联免疫吸附分析 PEX Potassium ethyl xanthate 黄原酸钾 LCP Large coat protein 大外壳蛋白 RdRp RNA—dependent RNA polymerase 依赖RNA的RNA聚合酶 CP Coat protein 外壳蛋白 IC．PCR lmmmlocapture PCR 免疫捕获PcR C1AB Hexadecyltimethy lammonium bromide 十六烷基三甲基渎化氨 NCR Non—coding region 非编码区 bp Base pair 碱基对 cDNA Complementary DNA 互补DNA EB Ethidium bromide 溴化乙锭 Tm Melting temperature 解链温度 DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 RACE Rapid amplification ofcDNA ends cDNA末端快速扩增技术 摘 摘 要 草莓是无性繁殖的多年生草本植物，受多种病毒的侵染，病毒严重危害 草莓生产。本论文旨在探索建立草莓几种主要病毒的分子检测技术体系，同 时对病毒的部分基因组序列进行分析。 1．草莓的核酸提取是进行草莓分子生物学研究的难点。对不同核酸分离 方法进行了研究，结果表明硅捕获法、改进的硅捕获法、Trizot法、PEX法、 Release—IT法及上海生工、V-Gene、Invitrogen公司的RNA提取试剂盒未能 从草莓中分离出高质量的RNA。先利用磷酸盐缓冲溶液研磨叶片，再利用 Qiagen试剂盒提取，可以有效地提取出草莓总RNA。而以CTAB缓冲液裂 解组织，结合LiCI沉淀、酚／氯仿抽提，从草莓野生资源、栽培品种、昆诺 藜中都可以提取出RNA，并可以稳定地进行ImPCR、多重R1二PCR、NASBA 反应。 2．建立了SMoV：SMYEV、SVBV的R1二PCR检测体系。利用嵌套PCR 对SMoV进行了检测，即首先利用第一对引物在低的退火温度下扩增20个 循环，再利用第二对引物在高的退火温度下扩增，比常规RT-PCR提高灵敏 度20倍左右。首次应用转录增强技术检测SMoV，比常规RT-PCR提高灵敏 度60倍左右。首次利用NASBA技术对SMoV迸行检测，引物在SMoV基 因组中位置同RT-PCR引物相同，40℃反应120 min，检测结果与R■PCR一 致。 3．在利用常规RT-PCR扩增SMoV、SMYEV和利用嵌套PCR扩增SMoV 的研究中，试管苗都比田间苗有更低的检测下限，意味着试管苗的病毒含量 比罔间苗商。 4为了监测RNA的质量和RT-PCR的有效性，线粒体NADH脱氢酶 ND2亚基编码基因转录的mRNA被作为内标。内标引物跨越内含子区域， 只对剪接后的mRNA进行特异扩增，可以较好的监测整个反应过程和避免 反应中的假阴性。首先利用软件分析引物间的互补性，再通过增加PCR缓 冲液浓度、调节引物浓度、提高退火温度、降低延伸温度和调整引物浓度， 建立r内标基础的多重RT-PCR同时检测SMoV和SMYEV的技术体系。此 外，还建立了多重RT-PCR检测SMoV、SMYEV和SVBV的技术体系，可 以在一次PCR反应中同时检测三种病毒，多重PCR体系稳定，检测结果与 以在一次PCR反应中同时检测三种病毒，多重PCR体系稳定，检测结果与 常规PCR一致。 5．对28个草莓栽培品种，共43个样品进行病毒检测。有4个品