细菌内毒素检验方法相关知识.docVIP

今天分享的内容有以下四方面: 内毒素的概念 内毒素的概念 2.细菌内毒素和热原的关系 3细菌内毒素的来源和控制方法 4.细菌内毒素的检验方法 1.首先谈谈细菌内毒素的概念。 细菌内毒素,英文称作Endotoxin ,是G?菌细胞壁个层上的特有结构,内毒素为外源性致热原,它可激活中性 粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质作用于体温调节中枢弓I起发热。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。. —般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin );它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体 外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球 菌以及少数革兰氏阴性菌。另一类为内毒素(Endotoxin )。是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。细菌在生活状 态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是 脂多糖中的类脂A成分。 2?细菌内毒素和热原的关系、热原反应 热原(pyrogen )系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内 源性低分子热原及化学热原等。 热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术 上仍有争议，热原不仅是细内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热 上仍有争议，热原不仅是细 内毒素。但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热 原，控制内毒素就是控制热原。 热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出沬恶心、呕吐 等症状，有时体温可升至40°C,严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。 去除细菌内毒素的方法 3.1吸附法 此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强,一 般用量为总容量的0.1%-0.5%，将溶液加热到70 °C左右保温一定时间效果更好。使用的活性炭应符合药典规 定要求。 3.2蒸f留法 此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。因此，凡适于蒸懈的药品均可用蒸懈法除去热原。 3.3热破坏法 此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器, 可用180°C干烤3小时，或250 °C干烤30min以上。 3.4强酸强碱处理法 此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。 其他，也可以采用过滤等方法去除热原。 4 ?热原及内毒素检验方法 4.1家兔热原法 由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法为各国药典规定的检查热原的法定方法。 《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家 兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。 检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为 0.001|jg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控,且不适用 于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。 4.2细菌内毒素检查法（堂试剂法） 细菌内毒素检查法系利用蜜试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限 量是否符合规定的一种方法.细菌内毒素的量用内毒素单位（EU ）表示。 细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引起的，1933年Boivin最 先由小鼠伤寒杆菌提取出来,进行化学免疫学方面的硏究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了 细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了 1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学 以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确 起来。 1956年美国人Bang发现美洲賞血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量 革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应从而创立了蜜试剂检测法。由于蜜试剂法简单 快速、灵敏、准确, 已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用賞试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或 半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用蜜试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固 酶使特定底物释放岀呈色团的多少来测定内毒素。 蜜试剂法检查内毒素的灵敏度为O.OOOlpg/ml,比家兔法灵敏10倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可 靠,适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制