表达马立克氏病病毒gi基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保护作用预防兽医学专业论文.docxVIP

陈志琳：表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保筻堡旦—— 陈志琳：表达马立克氏病病毒gl基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫保筻堡旦—— 三 表达马立克氏病病毒g I基因重组鸡痘病毒的构建及 其免疫保护作用 研究生姓名： 陈志琳 指导教师姓名：崔治中教授 秦爱建教授 30年来抗马立克氏病(MD)疫苗有了很大的发展，抗MD疫苗有下列几种： ①单价疫苗，包括血清III(HVT)，血清II型(sB-1)及致弱的血清I型(CVl988) MDV疫苗。②多价苗，包括二价苗(血清I型+血清II型，血清I型+血清III型 和血清Ⅱ型+血清III型)及三价苗。伴随着抗MD疫苗的发展，马立克氏病病毒 (MDV)本身也在不断突变、演化，毒力不断增强，常规的单价苗、多价苗已难 以控制毒力不断增强的MDV，在过去的lO年中，科学家们通过对MDV分子生 物学的研究，力图研制出比现在常规疫苗效果更好、使用更方便的抗MD基因工 程疫苗。MDV分子生物学的研究进展，MDV全基因组测序工作的完成，及MDV 一些重要基因的鉴定、定位及结构与功能方面的研究成果，促进了马立克氏病基 因工程疫苗的研制和开发。MDVgB糖蛋白是MDV主要保护性抗原。rFPV-gB 及rHVT—gB己显示良好的保护性免疫， 但仅一个靶抗原，其免疫保护性仍然有 局限性，因此人们也在寻找除gB之外， 其他与保护性有关的抗原成分作为基因 工程目的基因，对疱疹病毒囊膜糖蛋白的研究发现，gD、e,B、gI、gC、gE和gG 具有免疫保护作用，而把多个靶抗原联合使用时，具有协同免疫保护作用。糖蛋 白gI是疱疹病毒中重要的囊膜糖蛋白，它可与其他囊膜糖蛋白组成双价或多价疫 苗，提高单一囊膜糖蛋白的免疫保护效力。此外，有研究报告表明gI的同源编 码产物在细胞问传播、毒力介导、FC受体活性等方面都起一定的作用。以MDV gI作为靶抗原，开展保护性免疫研究，国内外未见报道。本研究以MDV gI为研 究对象， 以鸡痘病毒(FPV)中国株为载体，构建表达MDV gI基因的重组鸡痘 病毒(rFPV)， 在构建成功表达MDV gI的rFPV的基础上，进一步分析rFPV—gI 2 2 扬州大学博士学位论文 的稳定性及鸡对rFPV．gI的抗体反应性，然后研究它的免疫保护效力，为研制 rFPV．MDV．豇基因工程疫苗，进一步开发多价MDV基因工程重组疫苗奠定基础。 根据MDV 648A株病毒基因组密基因序列，我们设计了两个引物，用PCR 扩增出MDV gl基因。通过琼脂糖凝胶电泳，获得一条1060 bp DNA条带，与 MDV gI基因的大小是一致。在此基础上，用Qiagen公司胶回收试剂盒来纯化 PCR产物。用SmaI及XhoI来酶切PCR产物。用Smal和SalI酶切鸡痘病毒转 移质粒载体pFGll75．1。连接，转化大肠杆菌DH5 a，转化菌经筛选后，得到一 个含gI基因的阳性克隆，进一步纯化此阳性克隆DNA。用全自动测序仪测定插 入片段DNA序列，证明插入片段DNA序列与MDV．648A．gI序列完全一致。此 含MDV gl基因的重组转移质粒命名为pFGgm75—1。通过脂质体方法，将 pFG苫11175．1转染已感染FPV野毒(州)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，孵育3天后， 通过蓝斑筛选法，筛选纯化四次后得到纯化的rFPV， 用PCR扩增rFPV DNA， 证实此rFPV含MDV gl基因。用FPV(叭)及rFPV感染96孔板上CEF，用PBS 洗涤，丙酮固定，然后加抗gI单克隆抗体3712孵育30分钟，PBS充分洗涤后， 与抗鼠IgG荧光标记抗体作用，结果显示，rFPV感染的CEF有很强的荧光，而 FPV(Ⅲ)感染的CEF没有荧光。说明MDV gI得到表达，此表达MDV gI基 因rFPV命名为rFPV-MDV 6489i。 用rFPv．MDV6489I感染CEF，传代20次后，此rFPV仍然能够在CEF上稳 定复制。用104PFU rFPV．MDV6489[及FPV(嘶)分别接种1日龄SFP鸡，饲养 于带正压过滤空气隔离器中，接种前及接种后20天采血收集血清，用间接免疫荧 光法(IFA)分析血清与感染MDV的CEF反应情况。结果表明接种FPV-MDV6489I 后鸡血清中含有抗gI抗体。 用104或106PFu rFPv．MDV 648茁接种1日龄sPF鸡和蛋鸡，在接种后10 天后用MDV RBlB攻毒，隔离饲养60天，在此期间，解剖死亡鸡，检查记录MD 大体病变，饲养第60天扑杀存活鸡，统计记录MD大体病变。接种104PFU rFPV 的伊莎蛋鸡的保护指数为22．97， rFPV．gI免疫接种组MDV发病率及死亡率低于 FPV(、vt)接种组，但差异不显著。接种106PFU rFPV