格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌生物固氮作用的研究微生物学专业论文.docxVIP

中文摘要用Klebsiellapneumoniae的搬∞匿基因、Azospirillum 中文摘要 用Klebsiellapneumoniae的搬∞匿基因、Azospirillum brasilense Yu62的ni／hr基因的 启动子序列和draTG基因探针分别与Magnetospirillum属的M magnetotacticum和M gryphiswaldense 总DINA杂交，结果为阳性。验证了Ba纠linski等用砌。如p扣f盯踟 rubrum的nifHDK为探针与^z magnetotacticum和^z gryphiswaldense的DNA杂交的结 果。同时也证明在这两个菌中存在draTG基因。 参照已知数种固氮菌的nifI-l和draG基因序列，设计了扩增M gryphiswaldense的 删曰和加G中间区域内保守性较强的序列的寡核苷酸引物，分别对M gryphiswaldense 的总DNA进行PCR扩增，扩增出了所需要的目的片段。对所扩增的大小约为300bp的 ngn’}段的测序表明，该片段与其它固氮菌的砌确相关区域有较高的同源性，与M magnetotacticum、尼rubrum和Rhodobactersphaeroides比较接近。 用足rubrum的nifHDK和draTG基因在NCBI数据库中进行M magnetotacticum基因 组的同源性搜索，发现M magnetotacticum的”孵∞卿加zG基因定位于confi93823qb， 利用Dnaman软件系统分析了该菌的nifltDK和draTG基因，同源性比较表明其与尼 rubrum更为接近。 通过碳源种类、浓度及其它营养成分对M gryphiswaldense生长的影响试验，确定 了培养该菌的最佳培养基。在5 L自控发酵罐中。建立了固氮条件下肘gryphiswaldense 的深层培养技术。在以乳酸钠为碳源的限氮培养基中，通入含0．4~o’8％02的氮气，pH 和温度分别控制在7．2和30C，经三次补料培养21小时，细胞密度013600．。达1．3，最高 固氮活性为217 nmolC2Hdh／OD600nIn。利用80 L自控发酵罐进行扩大培养，获得了相似 结果。铵和氧对固氮活性有明显的调节作用，结合用draTG基因为探针的杂交试验， 进一步明确了该菌具有固氮酶翻译后的活性调节系统。 从M g，)∞抽pd№中分离并纯化了有活性的钼铁蛋白，其与K．pneumoniae的铁 蛋白的重组活性为341．3 nmolC2Hdmg／min，从酶学水平上证明了该菌的生物固氮。但 这一数值约为五l：mew／noniae自身两组分组合的活性的l，3。说明它们的固氮酶系统存在 有差异。 关键词：Magnetospirillum gryphiswaldense-固氨酶，固氮活性调节，深层培养 ni．[HDK，draTG AbstractGenomic Abstract Genomic DNA from M gryphiswaldense and M．magnetotacticum showed positive heterologous hybridization with nifHDK gene probe from Klebsiella pneumoniae．draTG gene probe and n／fn gene promoter probe from Azospirillum brasilense Yu62．These experimental results confirmed the Southern bolt result obtained by Bazylinski et al and indicated the presence ofnitrogenase structural gene and draTG gene in M gryphiswaldense and M magnetotacticum． According to the conservative sequences of several n柑and draG genes from different nitrogen-fixing bacteria,two pairs of degenerate primers were designed and synthesized．Using the total DNA ofM gryph豇waldense ns template，about 300bp月归fragment and 500bp draG fragment were amplified respectively by PC