肺癌细胞来源的外泌体中microrna差异性分析中西医结合基础学专业论文.docxVIP

大连医科大学硕士学位论文目录 大连医科大学硕士学位论文 目录 一、摘要 1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 4 二、正文 7 (一)引言 7 (二)材料与方法 8 (三)结果 14 (四)讨论 ·· ·23 三、结论 26 四、参考文献 27 五、综述 31 (一)综述 31 (二)参考文献 37 六、致谢 40 万方数据 大连医科大学硕士学位论文肺癌细胞来源的外泌体中microRNA差异性分析 大连医科大学硕士学位论文 肺癌细胞来源的外泌体中microRNA差异性分析 硕士生姓名： 李莫 指导教师：刘晶教授 专业名称：中西医结合基础 摘要 目的：通过对不同类型肺癌细胞和正常肺上皮细胞分泌外泌体中microRNA 的提取，统计分析得到差异性的microRNA，从而筛查出外泌体与肺癌的诊断和 转移具有相关性的microRNA，拟为肺癌的临床诊断与治疗提供以microRNA为 代表的分子标记物。 方法：从中科院上海生命科学研究院细胞资源中心购买三种肺癌细胞95D (人高转移肺癌细胞)、HCC827(人非小细胞癌)、NCI—H1395(人肺腺癌)以 及HBE(正常肺上皮细胞)。然后对不同类型肺癌细胞及正常细胞进行离心后贴 壁法培养细胞，肺癌细胞培养仪器和设备为美国Gibco公司的RPMI．1640培养 基、胎牛血清FBS(10％)、双抗(青霉素和链霉素)(1％)、Sigma公司的0．25％ 胰酶．0．02％EDTA和日本SANYO公司MCO一20AIC二氧化碳恒温培养箱；正常 细胞培养仪器和设备为美国Gibco公司的DMEM低糖培养基、胎牛血清FBS (10％)、双抗(青霉素和链霉素)(1％)、Sigma公司的0．25％胰酶一0．02％EDTA 和日本SANYO公司MCO一20AIC二氧化碳恒温培养箱。细胞传代培养方法如下： 吸出旧的培养；PBS冲洗2次，每次2ml；消化：用lml0．25％胰酶-0．02％EDTA 进行消化；终止消化：加入4ml培养基终止消化；吹打；100095min离心；弃上 清，加新的培养基，分别接种于新的培养瓶中。细胞传代培养后收集不同类型 细胞培养基，保证收集过程无菌无污染，将收集到的条件培养基冻存于一80。C冰 万方数据 大连医科大学硕士学位论文箱(1个月)，当收集至500ml时，统一解冻(4℃下)。接着进行超速离心法分 大连医科大学硕士学位论文 箱(1个月)，当收集至500ml时，统一解冻(4℃下)。接着进行超速离心法分 离提取外泌体，方法如下：在20009的离心力条件下持续离心20min，留上清； 在100009的离心力条件下持续离心30min，留上清；用0．22 u m的滤膜进行超 滤；再在]000009的离心力条件下持续离心70rain，弃上清；用PBS对每只离 心管沉淀进行重悬后，集中于一只离心管中，补足PBS后再次离心。滤纸吸出 残留管壁的PBS后，用200ul的PBS对沉淀进行重悬(残留约50ul液体)。最 后对外泌体浓度用bea试剂盒进行测定，用RNA质检、加poly(A)尾、生物素标 记、杂交、洗染和扫描等方法基因芯片处理microRNA，以对比基因之间的差异 性。 结果：透射电镜观察到超速离心后的溶液富含直径30一]00nm的囊泡结构， 最小直径38nm，最大直径100nm，总体直径平均值95％的可信区间为(72．613 ±3．845nm)。经提取外泌体中的microRNA，对比三种肺癌细胞外泌体与正常肺 上皮细胞外泌体中的microRNA成分差异。结果如下：HCC827(人tH,细胞肺 癌细胞．腺癌)与HBE(正常肺上皮细胞)相比，上调microRNA数为36，下调 microRNA数为26，95D(人高转移肺癌细胞)与HBE(正常肺上皮细胞)相比， 上调microRNA数为60，下调microRNA数为22；NCI．H1395(人肺腺癌细胞) 与HBE(正常肺上皮细胞)相比，上调microRNA数为295，下调microRNA数 为25。三种肺痛细胞外泌体中mieroRNA对比正常细胞均有上调10倍以上的 mieroRNA共有3种，分别是hsa-miR．3960，hsa-miR一6729—5p，hsa—miR一6090； 对比正常细胞均有上调5倍以上的microRNA共有4种，分别是hsa-miR．6803—5p， hsa—miR一6087，hsa-miR．638，hsa-miR．6089；对比正常细胞均有下调10倍以上 的mieroRNA有1种，是hsa-miR．155．5p。 结论：人体肺癌细胞和正常肺上皮细胞可以分泌外泌体， 外泌体最小直径 38nm，最大直径100nm，总体直径平均值95％的可信区间为(72．613--+3．845nm)。 并且这些外泌体可以被人体肺癌细