泛素特异性蛋白酶usp13的分子克隆和表达流行病与卫生统计学专业论文.docxVIP

\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\m川川mw Y190136? 目录 中文摘要…………，寸 英文摘要……… 4 研究论文泛素特异性蛋白酶 USP13 的分子克隆和表达 材料与方法………… 9 结果…………… ….19 附图 …… .25 附表…..…川………..……..川……... ...…… .44 讨论………………… 45 结论……………………………………………………………...…...…川…-4 6 参考文献……………..……..…...…………..……..……..……………..……..……………·………… ..47 综述泛素，蛋白酶体系统与神经系统疾病……… 50 致谢…...…..………………………·… .60 个人简历……..……………… 61 中文摘要泛素特异性蛋白酶USPl 中文摘要 泛素特异性蛋白酶USPl 3的分子克隆和表达 摘 要 目的：蛋白质的泛素化修饰是细胞内的一种基本调控机制，参与调 控细胞循环，DNA修复，信号转导和转录活化等多种细胞进程。这种转 录后修饰是一种动态的、可逆的过程，由多种泛素结合酶和去泛素化酶 调节控制。其中去泛素化酶可以特异性的去除泛素化蛋白底物上的泛素 分子，从而调控细胞进程。 去泛素化酶家族大约有95个成员，按结构和功能分为五种类型，包 括泛素羧基末端水解酶(UCHs)，泛素特异性蛋白酶(USPs)，含 Machado．Joseph结构域的蛋白酶(MJDs)，卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs) 和JAMM Moti蜃白酶。USPs是去泛素酶家族中种类最多，结构最为复 杂的一类，人类有54种USPs，它们的氨基酸序列都含有高度保守的结构 域：Cys，His和Asp／Asn结构域。 本课题所研究的泛素特异性蛋白酶1 3(USPl3)属于USPs家族，但 对于USPl3的功能活性和组织分布等都还没有详尽的研究报道。本研究 通过对大鼠脑组织和人类TE．1食管癌细胞株uspl3基因的克隆，了解 ．uspl3在大鼠不同组织中的分布情况，建立去泛素化酶检测体系，寻求检 测USPl3去泛素化活性的最佳方法，为进一步研究USPl3的活性和生物 学功能奠定基础。 方法： (1)运用分子克隆的方法克隆uspl3基因。采用TRNzol裂解法提取 大鼠脑组织总IⅢA，采用分段扩增的方法，运用反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)分别扩增获得uspl3．5 7和uspl3—3’。将uspl3基因5’和3’分别克 隆至pGEM．T easy载体，通过蓝白斑筛选实验确定阳性克隆并应用碱裂 解法提取质粒，进行双酶切鉴定及测序分析。 (2)采用荧光定量PCR(Real．Time RT-PCR)2出Q相对定量方法检 测卿J3在大鼠脑组织、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、骨骼肌、脾脏和睾丸 中的相对表达水平。以GAPDH基因作为内参，将标本间RNA的质量和逆 转录效率的差异进行标准化。以uspl3在脑组织中的表达水平作为校准样 中文摘要本，比较各组织uspl3表达水平的差异。 中文摘要 本，比较各组织uspl3表达水平的差异。 (3)GST-USPl3融合蛋白的表达首先将uspl3．5’基因克隆至iJpGZX． 6p．1原核表达载体，得至IJpGEX．uspl3．5 7质粒，然后将uspl3．3’基因克隆 至IJpGEX—uspl3．5’质粒中，最终得至IJpGEX．uspl3质粒。在大肠杆菌DH5a 中表达，获得120 kDa左右的GST-USPl 3融合蛋白，同时检测融合蛋白 GST-USPl3的可溶性。 (4)构建两种去泛素化酶活性检测体系，检测大鼠USPl3去泛素化 酶活性。①T7．USPl3／GST-Ub52方法采用定向克隆的方法构建pAC．T7． uspl3质粒，可表达带有T7标签的T7．USPl3蛋白。pAC．T7。uspl3表达质 粒与标准底物(GST-Ub52)表达质粒pGEX．Ub52共转化BL21感受态细 胞，经IPTG诱导后共表达，研究去泛素化酶的活性。以GST．Ub52做为标 准底物，分子量为45 kDa，去泛素化后分子量为36 kDa。以去泛素化酶 USP46作为阳性对照。用GSH．Sepharose．TM Resin纯化蛋白系统纯化GST 融合蛋白，进行10％SDS．PAGE电泳检测。②GST．USP／Ub．Met．D．gal方 法以GST．USPl3融合蛋白的表达质粒pGEX．uspl3矛1]表达Ub．Met．p．gal融 合蛋白底物f拘pAC．M．p．gal质粒共转化BL21感受态细胞，经IPTG诱导后 共表达，用anti．p．gal抗体进行蛋白印记分析。以USP46