单环刺螠urechisunicinctus交替氧化酶基因的克隆及其诱导表达细胞生物学专业论文.docxVIP

1111 1111 1 1 II I I III II U II IIl ＼1 926604 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 (洼!如遗直基丝益薹缱型主塑煎!奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：蒯 签字日期：力，／年，月易El 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公 众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：腓 导 师 签 字 、．【 艺 专秒 签字日期：≯7／年f月E1 签 字 日 期 2 川 年 厂 k丫肜 _) 日 单环刺缢(Ureehis 单环刺缢(Ureehis unicinctus)交替氧化酶的克隆及其诱导表达 单环刺蜢(Urechis unicinctus)交替氧化酶基因的克隆及其 诱导表达 摘要 硫化物(H2S、HS’、 S2-)是一种广泛分布的有毒物质，它能够抑制线粒体 电子传递的终端氧化酶一细胞色素氧化酶，从而增加活性氧的产生，造成机体 氧化胁迫甚至导致最终的死亡。然而一些栖息于富硫环境的海洋无脊椎动物却具 有耐受、代谢和利用硫化物的能力。沿岸底栖动物——单环刺蜢已被揭示具有一 定的耐受和代谢硫化物的能力，本实验我们定位在线粒体硫化物氧化电子传递分 支途径中的一个关键酶——交替氧化酶，开展其基因克隆、硫化物暴露下其 mRNA表达分析，以期揭示单环刺蜢AOX的生物学特性；进一步在硫应急下， 通过该基因的表达和细胞色素c氧化酶的活性变化，分析了单环刺蜢在硫化物环 境中的适应能力，为深入探讨硫化物代谢的分子机制提供科学依据。 采用同源克隆策略并结合RACE技术克隆获得单环刺蜢交替氧化酶全长 eDNA序列，长1725 bp，其中5UTR(Untranslated Reagion，非编码区)为288 bp； 3UTR为390 bp；开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)长1047 bp，编码 348个氨基酸。蛋白理论分子量为39．49kDa，理论等电点pI为8．49；氨基酸序 列中含有AOX所特有LET,NERMHL，LLEEA，及REDE H4个保守区，并含 有1个泛醌结合位点(Q．binding site)；TMMHM预测显示该蛋白具有2个跨膜 区域(TMHelix I 170．192 aa and TMHelix II 233．255 aa)。 采用荧光相对定量PCR技术检测显示了硫化物暴露后，单环刺嗌体壁和呼 吸肠AOX mRNA表达呈现浓度．时间递增的关系。在50州及150州硫化物浓 度下两个组织的AOX mRNA表达均呈显著性增高，并随着暴露时间的延长，持 续升高。 对单环刺蜢体壁和呼吸肠线粒体细胞色素c氧化酶活性检测结果显示，酶活 性在硫化物暴露6 h时到达最大值，随着暴露时间的延长，其活性下降。150州 硫化物暴露组的虫体在48 h时活性被完全抑制。 本实验硫化物暴露下，单环刺嗌AOX mRNA的表达与细胞色素c氧化酶活 性呈现负相关，说明AOX在单环刺蜢硫化物氧化解毒中起着重要的作用。 i． 单环刺蟠(Urechis 单环刺蟠(Urechis unieinctus)交替氧化酶的克隆及其诱导表达 关键词：单环刺蟮；交替氧化酶；细胞色素c氧化酶：电子传递链； 线粒体硫化物氧化解毒 单环刺缢(Urechis 单环刺缢(Urechis unicinctus)交替氧化酶的克隆及其诱导表达 Molecular cloning and expression analysis of alternative 0ⅪdaSe lI．om t／九鼬ZS unicinctuS ● tT Abstract Sulfide(the sum of HES，HS。and S2_)is a well known and widely distributed toxin that inhibits many enzymes involved in aerobic metabolism including the mitochondrial