细胞核与线粒体的分级分离一.pdf

中国试剂网 3.8.3.2 细胞核与线粒体的分级分离 一、原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相 同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离 心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成 为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质 (即0.25mol ／L 蔗糖一0.003mol ／L 氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及 其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation) 由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒 沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构， 如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开 始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最 重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1 ．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去 除结缔组织)尽快置于盛有 0.9 ％NaCl 的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用 滤纸吸去表面的液体。 2 ．将湿重约1g 的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml 预冷的0.25mol ／L 蔗糖一0.003mol ／L 氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后， 再全部加入。 3 ．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左 手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5 次，用3 层纱布过 滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。 4 ．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm ，离心15 分 钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线 中国试剂网 3.8.3.2 粒体用；(2) 同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行 下一步骤。 5 ．用6ml0.25mol/L 蔗糖一0.003mol ／L 氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm 离心15 分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上， 涂片③，自然干燥。 6 ．将①、②、③涂片用l ％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果 分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。 三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤 1 ．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm 离心20 分钟，弃上清，留取沉淀物。 2 ．加入0 ．25mol ／L 蔗糖一 0 ．003mol ／L 氯化钙液lml，用吸管吹打成悬 液，以17000rpm 离心20 分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0 ．25mol ／L 蔗糖一0.003mol ／L 氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签) 。 3 ．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片) ， 各滴一滴0.02 ％詹纳斯绿B 染液盖上盖片染20 分钟。 (二)结果 油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B 染成蓝绿