白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析-食品科学.PDF

58 2018, Vol.39, No.02 食品科学 ※生物工程 L 白丝北里孢菌 -谷氨酸氧化酶的异源 表达及酶学性质分析 陈 稳，李由然，顾正华，丁重阳，张 梁，石贵阳* （江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，生物工程学院，江苏 无锡 214122 ） 摘  要： L α α α 为实现从 -谷氨酸到 -酮戊二酸（ -ketoglutaric acid ， -KG ）的高效生物转化，将来源于白丝北里孢 Kitasatospora setae L L Escherichia 菌（ KM-6054 ）的 -谷氨酸氧化酶（ -glutamate oxidase ，LGOX ）在大肠杆菌（ coli ）中实现异源表达，并研究其酶学特性。根据LGOX 的氨基酸序列和大肠杆菌系统偏好性合成LGOX全基因 / β 序列，并通过pET28a （＋）DE3系统在大肠杆菌中实现了功能表达。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl- - D / / -thiogalactoside ，IPTG ）终浓度为0.1 mmol L ，20 ℃诱导18 h，重组大肠杆菌粗酶液酶活力可达49.10 U mL 。 / 亲和层析获得酶比活力为45.98 U mg 纯酶，十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰氨凝胶电泳条带显示蛋白分子质量大小 K / V 约为70 kDa 。酶学性质研究表明：其最适反应温度和pH 值分别为40 ℃和6.0 ； m 值为1.23 mmol L ， max 值为 μmol/ L E. coli 76.24 （min ·mg ）， -谷氨酸为该酶的最适底物。本研究确定了LGOX在 BL21 中的异源表达及酶学特 α 性，为生物转化合成 -KG提供了新的参考途径。 L α 关键词：白丝北里孢菌； -谷氨酸氧化酶； -酮戊二酸；异源表达；酶学性质 Heterologous Expression and Characteriza