生物化学实验PPT课件 7蔗糖酶的制备和活力测定.pptVIP

实验七 蔗糖酶的制备和比活力的测定 比色法测酶活性的原理 在蔗糖酶催化下，蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖,最适pH值为3.5-5.5。 通过测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖酶的活力，同时测定蛋白含量，从而求得酶的比活力。 酶活力单位（U）：在特定条件下反应1min,每产生1mmol底物所需要的酶量，或是转化底物中1mmol的有关基团的酶量。实际是1ml 酶液所产生底物的量定为1ml酶液的活力 酶的比活力: 每mg酶蛋白质所具有的酶活力 酵母蔗糖酶的制备 各级分酶溶液活性的测定 （1）葡萄糖标准曲线的制备 （2）蔗糖酶水解蔗糖后还原糖含量的测定 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算 实验内容 蔗糖酶制备的原理 酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的,称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体,外酶约为27kDa(或22 kDa，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5kDa。 两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验采用研磨水抽提，提取纯化的主要是外酶。 制备蔗糖酶（教材p158/76） 研磨水抽提（级分I ）： 目的：提取酵母水溶性蛋白成分 研磨、离心、调pH为5，取 1.5ml作为级分I。剩余做热抽提。 热抽提（级分II）： 目的：去除不耐热的蛋白杂质 50℃热处理30分钟（摇），冰浴、离心后将上清转移到烧杯中，取1.5ml作为级分II。剩余进行乙醇抽提。 此时可以开始测比活力 乙醇抽提（级分III）： 目的：抽提能被乙醇沉淀的蔗糖酶 乙醇沉淀离心后的固体蔗糖酶，等量分装在两个1.5ml的EP管中，4℃保存，做为下两次实验中的酶 酶分离提纯的总目标是提高回收率及纯度，保持较高的酶比活力（低温操作） 上清测pH，用1M乙酸调pH至5.0，取出1.5ml用于测定酶活力和蛋白质含量 称取10g酵母和5g二氧化硅，放入研钵中 加预冷蒸馏水30ml，分多次加入，每次5ml，研磨30min 分装入两个离心管中，平衡后离心15min，4℃,10000rpm 上清再次同样条件离心 级分I 上清转入离心管中，50 ℃水浴30min 平衡后离心10min，4℃,10000rpm 上清转入小烧杯，取1.5ml用于测定酶活力和蛋白质含量 其余加入等体积预冷95%乙醇，搅拌均匀后放置10min 级分II 平衡后离心10min，4℃,10000rpm。沉淀分装到两个EP管中。 葡萄糖标准曲线的制备 以零号管调零，测520nm光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线 管号 试剂 ml 0 1 2 3 4 5 标准糖溶液 1mg/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.1M醋酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 dH2O 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 二硝基水杨酸溶液 2 2 2 2 2 2 混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 测定前，每管加 9ml H2O 酶活测定 （保留原管酶液，每管均设对照） 以标准曲线的“0”管调零，测520nm光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量 管号 试剂 ml 测定管 对照管 级分I 级分II 级分I 级分II 0.3M 蔗糖溶液 0.6 0.6 0.1M醋酸缓冲液 0.2 0.2 H2O 1.1 1.1 25℃水浴3min 酶(1:10, 1:50,1:100,1:200) 0.1 25℃水浴5min 二硝基水杨酸试剂 2 2 酶(1:10,1:50,1:100,1:200) 0.1 混匀，沸水浴 5min，流水冷却3min 测定前，每管加 9ml H2O 蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法） 参照蛋白质浓度标准曲线(预制)，计算出各级分蛋白质含量。 y=0.0093x X代表溶液的浓度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值 样品 0.5ml + 考马斯亮蓝染液 5ml，室温5min， 测OD595 样品： H2O 级分I （1:10） 级分I （1:50） 级分I （1:100） 级分I （1:200） 级分II （1:10） 级分II （1:50） 级分II （1:100