生物化学实验PPT课件 8蔗糖酶Km值测定.pptVIP

实验八 蔗糖酶Km值测定 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。 Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度。 不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。 测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本内容之一。 底物浓度对酶活性的影响 原理 原理 米氏方程和双倒数作图法 酶反应速度与底物浓度之间的定量关系 [S]表示底物浓度 Vmax表示最大酶促反应速度 Lineeraver-Burk（林-贝氏作图法） 实验步骤 一、蔗糖酶溶解 二、蔗糖酶稀释以及活力测定 三、底物对反应速度的影响（Km测定） 一、蔗糖酶的溶解 酶粉溶于1 ml蒸馏水，10000 rpm室温离心5分钟后去掉不溶物，此时即为酶原液。 二、蔗糖酶稀释以及活力测定 1、将酶原液按照一定比例稀释，建议1:10，1:20，1:50和1:100。不同稀释倍数的酶液各准备2 ml。 2、稀释后酶液的活力测定。 为什么要将酶液进行稀释？ 为什么选择合适酶活力的酶液进行Km测定？ 3、葡萄糖标准曲线的制备。 酶活力预试 1 2（对照） 0.3M蔗糖溶液ml 0.60 0.60 H2O 1.1 1.1 pH5.0醋酸缓冲液ml 0.2 0.2 25℃水浴中保温3min 稀释后的蔗糖酶溶液ml （1:20; 1:50; 1:100; 1:200; ） 0.1 0 25℃水浴5min 二硝基水杨酸试剂 2 2 稀释后的蔗糖酶溶液ml （1:20; 1:50; 1:100; 1:200） 0 0.1 沸水浴煮5min 取出后经自来水冷却3 min，加入9 ml蒸馏水，以对照管调零点， 于520nm处测光密度值。 要求测得的A520nm值在标准曲线范围内靠近最大值。 为什么？ 葡萄糖标准曲线的制备 加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（100℃）中准确煮5 min，取出用自来水冷却3min，加入9 ml蒸馏水，混匀后以零号管调零，于520nm处测定光密度。 以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 1mg/ml标准葡萄糖溶液 ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.1mol/L醋酸缓冲液 pH5.0 ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 H2O ml 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 二硝基水杨酸溶液ml 2 2 2 2 2 2 底物浓度与酶促反应速度 管号 试剂 1 2 3 4 5 6 7 0.3 M蔗糖溶液ml 0.04 0.06 0.08 0.10 0.20 0.40 0.60 H2O 1.66 1.64 1.62 1.60 1.50 1.30 1.10 pH5.0醋酸缓冲液，ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 25℃预热3分钟 加入0.1ml稀释合适倍数的酶液 25℃准确反应5 min，迅速加入2 ml二硝基水杨酸溶液 混匀，沸水浴5min，自来水冷却3min，加入9ml蒸馏水，以对照管调“0”，520nm测OD值。 每只试管均要做自身对照 结果处理 管号 结果 1 2 3 4 5 6 7 OD520 葡萄糖产量，mg v =[葡萄糖产量?10] 1ml酶在单位时间(5min)内的葡萄糖产量 (mg) [S]=0.3V/2 (mol/L) 1/[S] 1/v v代表生成产物葡萄糖的速率（5min单位时间内1ml酶液反应生成的葡萄糖的量）； [S]=0.3V/2 ： [S]代表底物蔗糖的摩尔浓度；V代表每只试管中加入的底物蔗糖的体积（ml）；2指的是反应的总体积是2ml；0.3为底物蔗糖的浓度。 思 考 题 Km值的含义及测定的方法。 * *