生物化学实验PPT课件 9正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响.pptVIP

实验九 正交法测定几种因素对 蔗糖酶活力的影响 目的要求 1.初步掌握正交实验设计方法的使用 2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值 实验原理 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较法。 本实验用正交法测定温度、pH值、底物浓度和酶浓度四种因素对蔗糖酶活性的影响。 pH对酶的影响 在一定的pH下，酶具有最大的催化活性，通常称此pH为酶的最适pH。 一般情况下：pH 4-8； 植物和微生物：pH5.5-6.5； 动物：pH6.5-8.0 原因： 1、过酸或者过碱影响酶的蛋白构想，使酶变性失活； 2、pH影响底物分子的解离状态； 3、影响酶分子中活性中心的某些基团的解离状态； 4、影响酶活性中心的构象，从而影响酶的专一性 温度对酶的影响 一方面温度升高，酶促反应速度加快。 另一方面，温度升高，酶的高级结构发生变化或者变性，导致酶活性降低甚至失活。 最适温度！ 酶对温度的耐受力与其存在的状态有关。 最适温度不是一个固定不变的常数！ 正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据 分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信 息”的实验设计原则。正交试验法的程序为下列八个步骤： 1、确定试验目的。实验目的是多种多样的，如找出产品质量指标的最佳组合、确定最佳工艺条件等。本实验的目的是为了提高酶的反应速度，提高酶的活力。 2、选择质量特性指标。应选择能提高或改进的质量特性及因素效应。对于本实验来说就是产物（葡萄糖）生成量的多少。 3、选定相关因素。即选择和确定可能对实验结果或质量特性值有影响的那些因素，可人为控制与调节的因素，如温度、pH等。这些因素之间有相互独立性。 4、确定水平。水平，又称位级，是因素的一个给定值或一种特定的措施，或一种特定的状态。水平也就是因素变化的各种状态。在确定水平时，应考虑选择范围、水平数和水平位置。如本实验的温度水平可以选择20℃、30 ℃、50 ℃三个水平。 5、选用正交表。应从因素数、水平数以及有无重点因素需要强化考察等各方面综合考虑选用正交表。一般情况下，首先根据水平数选用2或3系列表，然后，以容纳试验因素数，选用实验次数最少的正交表。如有重点考察的因素，则根据其多考察的水平数，选混合型正交表。 6、配列因素水平，制定实验方案。按随机原则，把因素配列于选用的正交表中，制定实验的顺序、时间等，即制定实验具体方案。 7、实施实验方案。按实验方案，认真、正确地试验，如实记录各种实验数据。 8、实验结果分析。对实验中取得的各种数据进行分析。如从数据中直接选出符合或接近质量特性期望值的实验条件组。如不能采用直观分析方法，则应采用其他分析方法，确定各因素主次地位可用极差分析方法，定量分析各个因素对实验结果的影响程度，则用方差分析方法。 实验步骤 1、实验设计： （1）确定指标：即实验的结果。本实验的指标是酶活 力。这里，用A520值表示。 （2）制定因素水平表：水平是因素变化的范围（通常 是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加 宽范围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件， 如下表1。 因素 水平 A 温度 （℃） B pH值 C 底物浓度 （ml） D 酶浓度 （ml） 1 20（A1） 3（B1） 0.1（C1） 0.02（D1） 2 35（A2） 4.5（B2） 0.3（C2） 0.06（D2） 3 50（A3） 6.5（B3） 0.6（C3） 0.1（D3） 表1：因素水平表 （3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、 L27（313）、L18（36×6）和L27（38×9）。本实验不考察 各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数 均为3的的四个因素，故选用L9（34）表，见下表2。 因 素 试管号 A （温度） B （pH） C （底物浓度） D （酶浓度） ① 1 1 1 1 ② 1 2 2 2 ③ 1 3 3 3 ④ 2 1 2 3 ⑤ 2 2 3 1 ⑥ 2 3 1 2 ⑦ 3 1 3 2 ⑧ 3 2 1 3 ⑨ 3 3 2 1 表2 ：正交表L9（34） 因 素 试管号 A （温度） B （pH） C （底物浓度） D （酶浓度） ① A1 B