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健康人与鼻咽癌患者鼻咽部菌群结构及多样性分析 广西医科大学第一临床附属医院放疗科广西南宁530021 【摘要】目的：比较健康人与鼻咽癌患者鼻咽部菌群结构的组成分布及多样化 表现，探讨细菌结构变化与鼻咽癌的关联。方法：使用T-RFLP分析技术分析对 比健康者及鼻咽癌患者鼻咽部群菌结构的差异。结果：9例健康者共获取82种 T-RFs片段，并以T-RF119、T-RF152、T?RF 235、T-RF 400的优势菌群为代表;而 7例鼻咽癌患者共获得91种T?RFs片段,优势菌群分别为T?RF62、T?RF 77、T-RF 146、T-RF 333 T-RF 400；多样性指数方面，鼻咽癌患者的香农指数、辛普森指 数、均匀度指数均低于健康人,但T?RFs数目明显增高(Plt;0.05)o结论：健康 人与鼻咽癌患者在鼻咽部的菌群构成和丰度存在明显差异；T?RF62、T?RF77、T?RF 146、T-RF 333所代表的优势菌群可能与鼻咽癌相关；与健康人相比，鼻咽癌患 者的菌属种类明显增多，但优势菌群减少，菌群结构的多样化程度下降，物种分 布均匀度较差。 【关键词】鼻咽癌；菌群；T-RFLP技术；多样性指数 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)全球每年总体发病率小于1/10 万，但在我国华南地区特别是广西、广东两省其发病率却大于20/10 73[1-2]o EB 病毒感染、遗传因素、环境影响等常见因素在鼻咽癌病因学中起重要作用[3?4]。 但随着分子牛物学的发展，不断有学者发现人体细菌群落结构的改变与肿瘤的发 牛发展可能存在某种关联。例如Burkit的淋巴瘤研究结果发现，EBV可能并非唯 一的感染性致癌因素，而是与其他微牛物如疟原虫的协同感染而促使细胞癌变 [5-6]o中南大学的研究组曾在鼻咽癌患者的鼻咽部发现纳米细菌，并认为可能与 鼻咽癌发病有关⑺。这些线索提示我们，了解鼻咽癌与健康人鼻咽部微牛物的 群落组成结构的差异，对鼻咽部肿瘤的病因学研究及防治有着极为重要的意义。 木研究通过分别对10例健康者及鼻咽癌患者的鼻咽部进行样木采集， 利用末端限制性酶切片段长度多态性分析技术(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, T-RFLP),比较两者间细菌菌群的组成结构及分布，根据香 农指数、辛普森指数、均匀度的多样性指数描述其多样化程度差异，探究鼻咽部 菌群结构的改变与鼻咽癌的可能关联，并为鼻咽癌的病因病机供基础数据和科学 依据。 1材料与方法 1.1标本 选择2013年9月至2014年4月在广西医科大学第一临床 附属医院放疗科的7例鼻咽癌患者为研究对象，年龄18?70岁，KPS评分gt;90, 并在近1个月内无抗生素、激素及免疫抑制剂使用史；采取调强适形放疗技术进 行治疗，治疗周期约6?7周。对照组为9例健康志愿者。对所有研究对象采集鼻 咽拭子样本共20份，使用400mu儿PBS缓冲液储存拭子样本并置于?20°C超低 温冰箱备用。 1.2鼻咽拭子DNA提取使用玻璃珠机械破碎法+溶菌酶裂解法结合 DNA提取试剂盒法(Beads-Lysozyme+QIA法)进行DNA的提取⑻。 1.3 T-RFLP技术 利用通用引物对16SrRNA基因可变区进行扩增。正 向引物 8F： 5LAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31,荧光标记 FAMtrade;；反向引物 1492R： 5LGYTACCTTGTTACGACTP3,荧光标记CY3。使用普通琼脂糖凝胶DNA 冋收试剂盒进行目的片段纯化冋收。纯化后的PCR产物经过Hha I和Msp I双酶 切消化后在ABI3100遗传分析仪上进行测序，得到的「RFLP图谱用GeneScan version3.7软件进行分析。 1.4数据分析方法 实验数据利用SPSS19.0统计软件分析处理，健康人 和鼻咽癌患者的T?RFs丰度的比较采用两样本均数t检验，当P值lt;0.05差异具 有统计学意义。通过BI0?DAP程序计算菌群结构的多样性参数：香农指数 (Shannon index H)、辛普森多样性指数(Simpson index D)^ 均匀度指数(Eveness index E)。 2结果 2.1健康者与鼻咽癌患者的鼻咽部细菌群落在构成和丰度上均有显著 差异 研究结果显示，9例健康志愿者共获取82种不同T?RFs片段，其中有 27种TR?F片段的相对丰度gt;l%,可视为优势片段，而相对丰度在前5名的优 势菌属在各个健康志愿者中均能检测岀，它们分别为：T-RF 119 (9.5%)、T-RF 152 (4.4%)、T-RF 235 (6.4%)、T-RF 400 (18.4%)；鼻咽癌患者共获取 91 种 T?R