假单胞菌转化DL-ATC合成L-Cys相关酶的分离纯化-微生物学专业论文.docxVIP

南开土学硕士学位论文 南开土学硕士学位论文 摘要 摘 要 L一半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及 饲料工业。本实验室从土壤中筛选获得了一株假单胞菌TS一1138，可转化DL-ATC 合成L一半胱氨酸。本研究从产酶及酶促反应条件优化、关键酶的分离纯化、酶 学性质以及菌株的微胶囊固定化等方面进行了研究，研究结果如下： 在单因素实验的基础上应用正交实验确定出假单胞菌TS．1138最佳产酶培 养基配方为(g／L)：葡萄糖30，DL—ATC 3，玉米浆2，尿素3，MnS04·5H20 0．007， K2HP04 3，FeS04·7H20 0．Ol，MgS04·7H20 0．5，NaCl 1．5，pH 7．5；于28℃、 140r／rain摇床培养1611后，细胞浓度和酶活力分别比优化前提高29．9％和23．8％。 建立了最佳酶促反应条件：完整细胞酶液(细胞培养液5倍浓缩)在43℃、 pus．0、DL-ATC底物浓度69／L时，进行酶促反应时转化率最高达到59．9％；超 声波破壁后酶液(5倍浓缩)在37。C、pH8．0、DL-ATC底物浓度为69m时进行 酶促反应时转化率最高达到79．1％。 采用去除核酸、盐析、凝胶过滤和离子交换等手段分离纯化得到电泳纯的 L-ATC水解酶、L．SCC酰胺水解酶和L．Cys脱巯基酶，分子量分别为37．5、42．8 和53．0KDa，三个酶的最适反应温度均为35℃，最适反应pH值分别为7．0、8．0 和7．0，均为嗜中温型酶，在pH6．0～pH9，0的范围内有较好的稳定性：三个酶的 Km值分别为O．67 mmol／L、O．15 mmol／L和2．37mmoFL，最大反应速度分别为 O．39x10一mmol／L．rain、O．42x103mmol／L．min和O．1lxl0～mmoFL．rain。 应用非均相反应合成了微胶囊固定化材料NaCS，并利用NaCS-PDMDAAC 微胶囊对TS一1138菌株进行了固定化，培养132h后胶囊内的菌浓为游离培养细 胞的6倍，催化活性为游离培养细胞的2．5倍；微囊化细胞静态、动态转化DL．ATC 合成L一半胱氨酸的研究表明，静态转化比动态转化在DL．ATC的转化率、达到 L一半胱氨酸最大量的积累所需的时间、反应装置的要求等方面均有一定的优势。 关键词：假单胞菌，L．半胱氨酸，DL．ATC，酶法转化，L．ATC水解酶，L．SCC 酰胺水解酶，L—Cys脱巯基酶，酶纯化，NaCS．PDMDAAC微胶囊，固定化。 南开文学硕士学往论文 南开文学硕士学往论文 Abstract ABSTRACT L-cysteine iS all elementary S—containing amino acid．which have been found utility as medicine,raw matedals for medicine,food additive，additive for cosmetics and fodder．In our 1ab，a strain Pseudomonas sp．TS．1138 that call convert DL．ATC to L—cysteine WaS selected．The conditions of enzyme producing and enzymatic reaction， purification of cdilcal enzymes and immobilization of the strain in microcapsule were smdied in detail．The results were as follow． The optimized enzyme producing medium containing glucose 30，DL—ATC 3，corn extraction 2,urea 3，MnS04‘5H20 O，007，K2I-IP04 3，FeS04·7H20 O．01， MgS04‘7H20 0．5，NaCl 1．5，pH 7．5 were obtained by orthogonal test on the base of single-factor test．弧e shake flaSk cultivations showed that eell concentration and enzyme activity were inereased 29．9％and 23