五种食源性致病菌多重PCR的条件优化和检出限-中国食品卫生杂志.PDF

五种食源性致病菌多重ＰＣＲ的条件优化和检出限分析———陈娟，等 —　　１３７— 实验技术与方法 五种食源性致病菌多重ＰＣＲ 的条件优化和检出限分析 陈娟，唐俊妮，李键，陈丽君 （西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都　 ６１００４１） 摘　 要：目的　 对沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核增生李斯特菌和福氏志贺菌５种食源性致病 菌的多重ＰＣＲ反应条件进行优化并分析方法的ＤＮＡ检测限。 方法　 根据沙门菌的ｉｎｖＡ 基因、金黄色葡萄球菌的 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７的ｅａｅＡ 基因、单核增生李斯特菌的ｈｌｙＡ 基因和福氏志贺菌的ｉｐａＨ 基因设计 ５对特异性引物进行多重ＰＣＲ，对反应条件包括镁离子浓度、引物浓度和退火温度进行优化试验，并确定该检测方 法的检出限。 结果　 最佳反应条件为金黄色葡萄球菌、沙门菌和福氏志贺菌引物浓度为０２５ μｍｏｌ／ Ｌ，单核增生李 ２＋ 斯特菌引物浓度为０４ μｍｏｌ／ Ｌ，大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７引物浓度为０３ μｍｏｌ／ Ｌ，Ｍｇ 浓度为２２５ ｍｍｏｌ／ Ｌ，退火温度为 ６０ ℃；在此条件下金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７、单核增生李斯特菌、福氏志贺菌的多重ＰＣＲ 的ＤＮＡ检出限分别为６４、３２、３２、８００和１６０ ｐｇ。 结论　 通过对５种引物的ＰＣＲ条件进行优化和检出限的分析，为 食品中该５种致病菌的快速检测奠定基础，对实际应用具有指导意义。 关键词：多重ＰＣＲ；扩增条件；优化；检出限；食源性致病菌；食品安全 中图分类号：Ｒ１５５；Ｒ１５５５；ＴＳ２０７４；Ｒ３７８　 文献标志码：Ａ　 文章编号：１００４⁃８４５６（２０１４）０２⁃０１３７⁃０５ ＤＯＩ：１０１３５９０／ ｊ．ｃｊｆｈ．２０１４０２００８ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｉｖｅ ｆｏｏｄ⁃ｂｏｒｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ＣＨＥＮＪｕａｎ，ＴＡＮＧＪｕｎ⁃ｎｉ，ＬＩ Ｊｉａｎ，ＣＨＥＮ Ｌｉ⁃ｊｕｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　 Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１５７∶Ｈ７，Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ａｎｄＳｈｉｇｅｌｌａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ　 Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｖＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，ｔｈｅ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ，ｔｈｅ ｅａｅＡ ｇｅｎｅ ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１５７∶Ｈ７，ｔｈｅｈｌｙＡ ｇｅｎｅｏｆＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ａｎｄｔｈｅｉｐａＨ ｇｅｎｅｏｆＳｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ，ｆｉｖｅｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ