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湖北科技学院 实验动物伦理委员会审查申请表 受理编号(N?)： 申请 人填 写的 相关 信息 申请单位(Name of organization)： 申请人学历：硕士 技术职称：无 实验名称：干眼眼表IL/17IL-17R的特征表达及其基因抑制效应 项目来源和编号： 项目名称：干眼眼表IL/17IL-17R的特征表达及其基因抑制效应 动物实验目的：通过建立小鼠干眼模型，研究IL-17及其受体各亚型在小鼠结膜、干眼发病过程中的表达变化以及抑制IL-17基因的表达对干眼的影响。 拟进动物情况 动物来源：通过建立小鼠干眼模型，研究IL-17及其受体各亚型在小鼠结膜、干眼发病过程中的表达变化以及抑制IL-17基因的表达对干眼的影响。 品种品系：C57BL/6 等级：SPF 规格：6-8周 数量： 60只 (♀ 0 只；♂ 60 只) 申请日期： 进驻日期： 2015年07月01日 结束日期： 实验方案 一、实验背景 白细胞介素17(IL-17)及其受体(IL-17R)是体内防御细菌、真菌和病毒感染的代表性细胞因子，同时也在多种非感染性疾病中发挥非常重要作用。近年虽有研究表明干眼症的发生存在免疫病理机制，但是关于角膜结膜组织IL-17/IL-17R的研究非常有限，如关于眼表IL-17起源、IL-17R介导信号通路、IL-17/IL-17各R亚型在眼表的分布及作用还不明确。因此，本课题通过分析IL-17、IL-17R各亚型在干眼中角结膜组织中的表达变化，阐明IL-17/IL-17R亚型在干眼症的作用及可能的机制，并通过短期或长期抑制IL-17R基因表达,探讨局部抑制IL-17R基因表达对干眼症影响。 本课题的实验目的是研究IL-17及其受体各亚型在干眼发病过程中的在结膜、结膜的表达变化以及抑制IL-17基因的表达对干眼病情发展的影响，为干眼的发病机制增加新理论，为其临床靶向治疗提供科学依据。小鼠干眼模型，与临床干眼的自然发展及病理改变较为相似，而实验中需要的角结膜及淋巴结等组织更获取。 大量文献表明C57BL/6小鼠能较好的模拟人干眼进程，且病理变化也与人干眼相似，可作为研究干眼的理想模型。 二、研究方案 1、实验分组 （1）取SPF级的健康C57BL/6小鼠20只，随机分成2组（A、B），每组10只，饲养周期21天；（2）取40只SPF级的健康C57BL/6小鼠，随机分成4组（1、2、3、4），每组10只，饲养周期为21天。 研究方法和内容 （1）先购买具有安全许可证的SPF级C57BL/6小鼠，适应性饲养7天才开始实验；（2）取健康C57BL/6小鼠20只，随机分成2组（A、B），每组10只，A组使用生理盐水点眼(0．90％，5微升/次，2次/d），B组使用苯扎氯铵溶液滴眼(0．20％，5微升/次，2次/d)诱导具有干眼表现。第7、14、2l天时分别对小鼠进行干眼临床评估，包括泪液分泌实验（Schirmer ）、泪膜破裂时间(break．up time，BUT)， 角膜荧光素钠染色，然后第21天采用腹腔注射过量水合氯醛（4.0%水合氯醛）的方法处死小鼠，取其角结膜、眼球及颈淋巴结组织石蜡切片后行免疫组织化学染色、免疫荧光，分别观察角结膜组织IL-17、IL-17Rs的表达。将所取部分角结膜、眼球及颈淋巴结组织分别提取蛋白，用western blot法分别检测角结膜组织IL-17、IL-17Rs的表达情况。取角结膜组织于RNA裂解液中裂解后，提取其RNA，行RT-PCR检测IL-17及IL-17Rs的mRNA的表达；（3）取40只C57BL/6小鼠，随机分成4组（1、2、3、4），每组10只，1组使用生理盐水点眼，2组使用苯扎氯铵局部点眼，3组在苯扎氯铵局部点眼前1小时给予IL-17（不同量5、10ug）局部点眼，4组在苯扎氯铵局部点眼前予以IL-17抗体（不同量5、10ug）局部点药，第7、14、2l天时分别对小鼠进行干眼临床评估，然后第21天采用腹腔注射过量水合氯的方法处死小鼠，取其角结膜上皮、眼球及颈淋巴结石蜡切片后行免疫组织化学染色、免疫荧光，比较观察IL-17及IL-17Rs的表达变化。将所取部分角结膜、颈淋巴结组织分别制成蛋白，用western blot法分别检测角结膜组织IL-17、IL-17Rs的表达情况。取角结膜组织于RNA裂解液中裂解后，提取其RNA，行RT-PCR检测IL-17及IL-17Rs的mRNA的表达。（4）小鼠进行干眼临床评估等操作时，采用合适剂量的麻醉剂对动物进行麻醉，小鼠：4.0%水合氯醛 按0.20-0.33ml/kg标准进行腹腔全身麻醉；保证各项操作在动物处于完全麻醉下进行。在麻醉前对麻醉剂进行复温，操作结束后用毛巾包裹动物，待其体温恢复后再回笼。（5）在对动物操作结束