基于光激化学发光免疫分析技术的酪氨酸激酶通路蛋白蛋白相互作用检测试剂的研制-应用生物学专业论文.docxVIP

硕士学位论文immunoassay，AlphaLISA)技术作为一种新型的免疫分析技术应运而生。该技术 硕士学位论文 immunoassay，AlphaLISA)技术作为一种新型的免疫分析技术应运而生。该技术 起源于单线态氧的分子能量传递的发光免疫分析技术(Luminescent oxygen channeling immunoassay，LOCI)，后来美国PerkinElmer公司研制了相关科研 试剂(AlphaScreen@)。做为一种新型定量均相免疫学的检测技术，它克服了需 要洗涤分离游离标记与结合标记的缺点。它拥有单线态氧纳米材料，激光技术和 半衰期短等优势，实现在均相中反应的操作。光激化学发光免疫分析技术具有很 多优势，该技术背景信号低，无放射性污染，操作简单，检测重复性好，不需洗 涤分离结合标记与游离标记，高灵敏度，高通量，易于自动化等优势。 本研究实验构建了重组真核表达质粒。并将重组真核表达质粒瞬转转染到293T 细胞中进行蛋白表达，并且对光激化学发光免疫分析(AlphaLISA)技术体系进行 优化，最后利用AlphaLISA技术对JAKl蛋白质以及通路蛋白的相互作用进行检 测，为进一步研究JAKl蛋白通路以及疾病的发生奠定基础。 方法： 1真核表达JAKl与STAT3 1．1从Hela细胞中提取总的RNA，通过RT-PCR获得JAKl与STAT3基因全长cDNA 序列，并将其克隆至真核表达载体PENTER中，构建重组质粒。将真核重组表达 质粒转染293T细胞，转染后检测蛋白转染和在293T细胞中的表达情况。 1．2在表达过程中进行转染试剂的优化，按照罗氏转染试剂说明书，严格操作进 行真核表达质粒转染，分别按照质粒跟转染试剂比例为1：I，1：2与1：3加入 对应罗氏转染试剂，轻柔混合，静置30min后，缓慢滴加入细胞中进行转染。最 后用免疫印迹方法显示结果，建立出最佳的转染试剂与质粒的转染比例。 1．3在表达过程中进行转染时间的优化，在最佳转染试剂用量的前提下，将重组 质粒分别转染293T细胞24h，36h，48h后收细胞裂解液，利用免疫印迹方法显 示结果，建立最佳的转染时间。 1．4利用免疫共沉淀检测JAKl与STAT3的相互作用，收集JAKl与STAT3质粒 共转染的293T细胞裂解液，用STAT3的抗体进行反应，免疫印迹用JAKl的抗 III 万方数据 摘要体进行检测。 摘要 体进行检测。 2光激化学发光免疫分析技术的建立与优化 采用AFP靶标双抗体夹心法建立并优化光激化学发光免疫分析试剂。 2．1参考标准品用标准品缓冲液(7．5％BSA、0．9％NaCl、50 mmol／L Tris-HCl、 0．05％NaN3、0．01％Tween一20，pH7．8)将AFP抗原配制成0，5，20，125，250， 500 U／L系列参考标准溶液，每瓶1 IIlL分装冻干4。C保存。 2．2抗体与受体微球连接将O．2 mg的AFP包被抗体加到有滤膜的离心管中， 80009离。66 min，用连接缓冲液pH 5．0，0．1 mol／L的MES重复洗涤6次后，将 lmg的受体微球加入到抗体溶液中，再加入10乩25 mg／mL NaBH。CN(用MES配 制)、1．25儿10％的Tween-20，用缓冲液MES将体积补充至U200此，放置在37℃ 避光振荡孵育48 h。加入用0．8 mol／L NaOH配制的10儿65 mg／mL CMO封闭液 封闭未结合位点，放置37℃避光孵育1 h后进行洗涤，即能得到己连接抗体的受 体发光微球，将受体发光微球浓度调整为5 mg／inL。 2．3抗体与生物素连接将lmg标记抗体加入到带有滤膜的离心管中， 以80009 离。66 min。用生物素标记缓冲液(0．1 mol／L、pH 9．5的Na：CO。／NaHCO。)重复洗涤 6次后，在抗体溶液中加入用二甲亚砜(DMSO)配制的101_LL 22 mg／mL活化生物 素，放置室温避光振荡孵育4 h后用PBS洗涤，并将其抗体浓度调整为0．5 mg／mL。 2．4光激化学发光免疫分析技术体系反应时间的优化 将反应时间设置梯度lOmin，15min，30min建立出最佳的反应时间； 2．5受体微球连接抗体的量的优化 保持发光微球的说明书用量为lmg，将AFP连接抗体制备一系列用量200“g， 150¨g，125pg，100肛g，分别按照以上受体微球连接抗体的方法进行连接。向 Optiplates微孔板中分别依次加入25虬受体发光微球化抗体、25儿生物素化 抗体、251虬L的AFP抗原，加贴封纸片，放置于37℃恒温振荡箱内避光振荡孵育 15 min。在黑暗条件