甲型H1N1流感病毒血凝素基因的表达和免疫原性分析-遗传学专业论文.docxVIP

扬州大学硕士学位论文 扬州大学硕士学位论文 2 甲型H1NI流感病毒血凝素基因的表达 和免疫原性分析 f f嬲嬲 研究生：马全刚 导师：焦新安教授 潘志明副教授 摘 要 流感病毒(influenza virus)是引起人类呼吸道感染及引起人类死亡的主要病因之一。人 类曾多次遭受过流感病毒大流行(1918年H1N1亚型，1957年H2N2亚型，1968年H3N2 亚型，1977年HINl亚型)。至今人类仍然无法征服流感病毒。快速检测及接种疫苗被认 为是控制并清除流感病毒经济有效的手段。实时荧光定量PCR检测流感病毒具有快速、特 异性高的特点，但花费昂贵，不适合大面积推广；当前使用的疫苗有流感减毒疫苗、灭活 疫苗、裂解疫苗等，这些疫苗能够在人体中产生保护性抗体，但是都有一定的缺陷，如减 毒疫苗具有毒力回复的潜在性危险，而后两种却很难产生细胞免疫应答。因此，迫切需要 研制一种快速的检测流感病毒的方法及新型有效的疫苗。 当前发表的许多文章都证实了流感病毒糖蛋白抗原的保护性作用，在这些糖蛋白抗原 中，血凝素(HA)的作用相当重要。HA具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒， 是主要的保护性抗原。因此，针对HA蛋白的重要性，以GenBank公布的A／California／05／2009 H1N1流感病毒HA基因为目的基因，从GenBank数据库中下载HA基因序列，进行全基 因合成，将人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到原核表达载体pET30a+上， 构建重组表达质粒，并转化E coli BL21(DE3)，以IPTG对重组菌BL21(DE3)(FlET-HA)进 行诱导表达，表达产物His．HA融合蛋白通过变复性后纯化。Western blot试验结果表明表 达产物His-HA融合蛋白能特异性地与人甲型H1NI流感患者阳性血清反应，证明表达产 物His．HA融合蛋白具有免疫反应活性。利用该His．HA融合蛋白的建立检测抗体的ELISA 方法，并探究ELISA方法的最适宜条件，ELISA方法的适宜条件为原核表达产物His．HA 融合蛋白以1一孔包板，检测血清的稀释度为1：80到1：640间；以建立的ELISA检测300 份人源血清样品，阳性血清数量为74份，阳性率为24．67％，并与商品化试剂盒进行对比， 符合率为98．65％，对比试验说明建立的ELISA方法具有可行性。 马全刚：甲型H1N1流感病毒血凝素基因的表达及其免疫原性分析 马全刚：甲型H1N1流感病毒血凝素基因的表达及其免疫原性分析 3 将人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到pFastBacl转移载体，转化DHSa， 然后在含Karl抗生素的LB平板上挑取阳性菌落，得到的重组转移质粒pF舔tBac．HA，再 提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E coli DHl0Bac中，发生 转座作用，在含庆大霉素、卡那霉素、四环素3种抗生素和X-gal／IPTG的LB培养板上， 筛选出白色菌落得到重组穿梭载体Bacmid-HA。经PCR鉴定为阳性后，采用阳离子脂质 体法转染到Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒，通过刀FA、SDS．PAGE及Westem blot试验证 实在Sf9细胞中HA蛋白得到表达。血凝试验结果表明表达产物HA蛋白血凝价为1：16， 血凝试验证实真核表达产物具有生物活性。将真核表达的HA蛋白以100蚓只的剂量，通 过皮下注射BALB／c小鼠，探讨其免疫原性，ELISA检测免疫小鼠血清的抗体效价，结果 显示，二免14天，HA蛋白免疫组的抗体效价与空白对照组之间呈现显著差异(pO．05)。 HA蛋白免疫小鼠血清血凝抑制试验血凝抑制价为1：16。ELISPOT检测免疫小鼠分泌细胞 因子几-4和脒吖脾脏淋巴细胞，结果显示产生IFN吖的分泌细胞少于产生也4的分泌 细胞，Prism软件包分析表明，两者存在显著差异(po．05)，免疫小鼠体内趋向于Th-2为 主的免疫应答。 关键词：甲型流感病毒H1N1亚型，血凝素，ELISA方法，免疫原性 扬州大学硕士学位论文 扬州大学硕士学位论文 4 Expression of HA gene of HINl sub够pe influenza A virus and its lmmunogenicity analysis M．S．candidate：Quangang Ma Advisors：Prof．Xin’an Jiao Associate Prof．Zhiming Pan Abstract hfluenza virus(rⅥis one of the deadliest human diseases and it can make human respira